Abundància relativa dels transcrits seleccionats, en els espermatozoides de pacients astenozoospèrmics i controls fèrtils mitjançant l’ús de la PCR quantitativa temps

real

Pacients astenozoospèrmics Controls fèrtils

(n= 16) (n=6)

Signficació estadística

(Test U Mann-Whitney)

Abundància dels transcripts (relatiu a la β-actina)

ANXA2 (2-ΔΔCt) 0,6 ± 0,1 2,4 ± 0,6 P < 0,005

BRD2 (2-ΔΔCt) 0,4 ± 0,1 2,1 ± 0,6 P < 0,001

mtND2 (2-ΔΔCt) 1,8 ± 0,4 2,6 ± 0,8 NS

mtND3 (2-ΔΔCt) 1,9 ± 0,5 1,9 ± 0,4 NS

OAZ3 (2-ΔΔCt) 0,4 ± 0,0 1,0 ± 0,3 P < 0,050

Font: taula basada en l’article de Jodar et al., 2012 (Veure annex II) . “Differential RNAs in the sperm cells of asthenozoospermic patients”.

Els resultats obtinguts mitjançant l’ús de la PCR quantitativa a temps real confirmen l’abundància diferencial de tres dels cinc transcrits seleccionats (ANXA2, BRD2 i OAZ3) entre pacients infèrtils astenozoospèrmics i els controls fèrtils normozoospèrmics (p<0,05; Veure taula 3.5). No obstant, en augmentar el número de mostres estudiades no s’han observat diferències significatives en l’abundància relativa dels dos transcrits mitocondrials seleccionats (Veure taula 3.5).

A continuació vam seleccionar els dos transcrits més diferencials, el ANXA2 i el BRD2, per estudiar la seva abundància relativa en un nou grup de pacients infèrtil que en aquest cas presentaven una mobilitat adequada (normozoospèrmics; Veure taula 3.1).

En el cas del ANXA2 la mitjana de l’abundància relativa del transcrit ± error típic de la mitja en els tres grups independents van ser els següents:

(i) Pacients astenozoospèrmics: 0,601 ± 0,158.

(ii) Pacients normozoospèrmics: 1,718 ± 0,540.

(iii) Controls fèrtils normozoospèrmics: 2,407 ± 0,636.

Podem veure que, tant en pacients normozoospèrmics com en els controls fèrtils, l’abundància del transcrit ANXA2 és superior a la que trobem en els pacients astenozoospèrmics. No obstant, mentre que quan comparem pacients astenozoospèrmics i controls fèrtils aquestes diferències són estadísticament significatives (Veure taula 3.5), quan comparem els valors obtinguts en els pacients astenozoospèrmics envers els normozoospèrmics les diferències observades no són estadísticament significatives (Veure figura 3.3.A).

Tot i això, sí vam observar una correlació positiva estadísticament significativa entre la velocitat progressiva dels espermatozoides (A+B) i els nivells d’abundància relativa del transcrit ANXA2 (p<0,005; Veure figura 3.3.B).

Figura 3.3. Abundància relativa del transcrit ANXA2 en tres grups d’estudi independents (pacients infèrtils astenozoospèrmics, pacients infèrtils normozoospèrmics i controls fèrtils)

A B

Nota:

A) Diagrama de caixes de l’abundància relativa del transcrit ANXA2 en les 3 poblacions estudiades.

B) Correlació positiva estadísticament significativa entre l’abundància relativa del transcrit ANXA2 i

la mobilitat progressiva dels espermatozoides (A+B). S’indiquen el valor de significació P-value i

el coeficient de correlació de Spearman (Rs).

P < 0,005

Rs = 0,540

Font: imatge basada en l’article de Jodar et al., 2012 (Veure annex II) . “Differential RNAs in the sperm cells of asthenozoospermic patients”.

En el cas del transcrit BRD2, la mitjana de l’abundància relativa del transcrit ± error típic de la mitja en els tres grups independents van ser els següents:

(i) Pacients astenozoospèrmics: 0,453 ± 0,095.

(ii) Pacients normozoospèrmics: 1,089 ± 0,408.

(iii) Controls fèrtils normozoospèrmics: 2,089 ± 0,203.

Com ja passava amb el transcrit ANXA2, els pacients astenozoospèrmics presenten una abundància inferior del transcrit BRD2, tot i que aquestes diferències únicament arriben a ser estadísticament significatives quan comparem pacients astenozoospèrmics i controls fèrtils (Veure taula 3.5; Veure figura 3.4.A).

En aquest cas també hi ha una correlació positiva estadísticament significativa entre la velocitat progressiva dels espermatozoides (A+B) i els nivells d’abundància relativa del transcrit BRD2 (p<0,05; Veure figura 3.4.B).

Els resultats que hem obtingut de l’abundància relativa dels dos transcrits (ANXA2 i BRD2) en el grup de pacients infèrtils normozoospèrmics ens mostra una situació intermèdia entre la població de pacients infèrtils astenozoospèrmics i de controls fèrtils, el que suggereix que hi ha un cert grau de disfunció per aquests transcrits en el grup de pacients normozoospèrmics. Aquest resultats suggereixen que un nivell baix d’aquests dos transcrits podria estar associat amb l’astenozoospèrmia i per tant podrien ser usats com a biomarcadors de l’estat de fertilitat dels pacients.

Figura 3.4. Abundància relativa del transcrit BRD2 en tres grups d’estudi independents (pacients infèrtils astenozoospèrmics, pacients infèrtils normozoospèrmics i controls fèrtils)

Nota:

A) Diagrama de caixes de l’abundància relativa del transcrit BRD2 en les 3 poblacions estudiades.

B) Correlació positiva estadísticament significativa entre l’abundància relativa del transcrit BRD2 i

la mobilitat progressiva dels espermatozoides (A+B). S’indiquen el valor de significació P-value i

el coeficient de correlació de Spearman (Rs).

P < 0,05

Rs = 0,363

A B

Font: imatge basada en l’article de Jodar et al., 2012 (Veure annex II) . “Differential RNAs in the sperm cells of asthenozoospermic patients”.

Com hem dit anteriorment, l’ANXA2 és una proteïna d’unió al calci que podria estar involucrada en diferents processos calci dependents. Els nostres resultats suggereixen que nivells baixos del RNA corresponent al gen ANXA2 podrien estar associats a una baixa mobilitat flagel·lar, ja que aquest procés és depenent del calci.

La BRD2 és una proteïna que confereix importants marques epigenètiques que poden regular tant la transcripció durant el procés de l’espermatogènesi com el del desenvolupament embrionari. Els nostres resultats confirmen els resultats trobats en un altre estudi, el qual observava una major quantitat del transcrit BRD2 en controls fèrtils que en pacients infèrtils (Garcia-Herrero et al., 2010). Aquests resultats suggereixen que uns nivells baixos del transcrit BRD2 podria estar associat a un error epigenètic de l’espermatogènesi, i que això es podria traduir en infertilitat.

1.4. Estudi dels transcrits de les protamines en pacients infèrtils astenozoospèrmics

En el nostre estudi també vam decidir incloure l’anàlisi dels transcrits de les protamines (PRM1 i PRM2), ja que existia certa base per pensar que podien estar relacionades amb la mobilitat. Està descrit que una relació de proteïna P1/P2 alterada contribueix a una condensació de la cromatina anòmala i que s’associa amb un increment dels trencaments de les cadenes de DNA (Castillo et al., 2011), fet que podria iniciar una senyalització d’apoptosi induint la inactivació de les mitocòndries i per tant, l’alteració de la mobilitat dels espermatozoides (Miyagawa et al., 2005). Es coneix que en mostres astenozoospèrmiques es detecta major lessió en el DNA (Ribas-Maynou et al., 2012).

Si observem les quantitats dels transcrits PRM1 i PRM2 que hem obtingut en l’anàlisi del

microarray, podem observar que la quantitat d’aquests és inferior en pacients astenozoospèrmics que en els controls fèrtils, tot i que aquestes diferències no són estadísticament significatives (Veure taula 3.6). No obstant, per tal de validar estudis previs, on mostraven diferències significatives en la quantitat d’aquests transcrits en individus astenozoospèrmics envers individus normozoospèrmics (Kempisty et al., 2007), vam decidir avaluar la quantitat relativa d’aquests transcrits en els tres grups independents de l’estudi mitjançant l’ús de la PCR quantitativa a temps real (Veure taula 3.6).

El resultats de la PCR quantitativa a temps real ens reafirmen els resultats dels estudis previs, ja que observem que els transcrits de les protamines són significativament inferiors en pacients astenozoospèrmics en comparació als controls fèrtils normozoospèrmics.

Taula 3.6.Valors obtinguts en l’estudi diferencial dels transcrits de les protamines (PRM1