Análisis de Flujos Metabólicos

Para comprender mejor el metabolismo de los ácidos grasos administrados al cultivo y su posterior incorporación en la síntesis de PHA, se esquematizó el flujo metabólico en la Figura 15.

Figura 15: Representación del análisis de flujo metabólico de los aceites vegetales y su incorporación al PHA. 1: µmoles de ácidos grasos suministrados. 2: Intermediarios

exclusivos de la β-oxidación de ácidos grasos. 3: µmoles de Acil-CoA teóricos

resultantes de la β-oxidación. 4: Intermediarios formados de condensación de Acetil-

CoA provenientes de la β-oxidación. 5: µmoles Acetil-CoA no utilizado para la formación

de monómeros; 6: µmoles de Acetil-CoA usado para la biosíntesis de novo de ácidos

grasos. 7: µmoles de Acetil-CoA utilizado para respiración y formación de biomasa. 8: µmoles de Acetil-CoA convertidos a CO2 por el Ciclo de Krebs. 9: µmoles de Acetil-CoA

resultantes de la oxidación del glicerol.

El análisis de flujos metabólicos fue realizado para cada uno de los cultivos realizados con los dos linajes bacterianos e con los diferentes aceites vegetales suministrados.

Las concentraciones de los ácidos grasos adicionados fueron estimadas con base en la composición de los ácidos grasos de los aceites vegetales, que fue

obtenida mediante el análisis realizado por cromatografía gaseosa de metil- ésteres. El análisis por cromatografía gaseosa determino la cantidad de cada uno de los monómeros formados. Monómeros obtenidos exclusivamente a partir de la β-oxidación de ácidos grasos (3HDd∆6 y 3HDd∆5,7) o de la biosíntesis de ácidos grasos (3HDd∆5) fueron fácilmente detectados. Para los monómeros que pueden ser producidos tanto a partir de la β-oxidación como por la biosíntesis de

ácidos grasos (3HHX, 3HO, 3HD y 3HDd), con el objetivo de cuantificar la contribución de cada una de esas vías metabólicas en la formación de esos monómeros, fue utilizado el siguiente criterio: se admitió que las cantidades de 3HHX, 3HO, 3HD, 3HDd y 3HDd∆5 producidos por la síntesis de novo guardan la proporción 3:20:70:3:4; o sea, guardan la misma proporción obtenida cuando únicamente la biosíntesis de ácidos grasos contribuye con los monómeros para la biosíntesis de PHA, como por ejemplo son suministrados carbohidratos como fuente de carbono (Sanchez et al., 2003). Así, los monómeros derivados de la b-

oxidación de ácidos grasos fueron estimados considerando la diferencia entre aquellos que habrían sido provenientes de la biosíntesis de ácidos grasos e el total de monómeros detectados por cromatografía gaseosa.

Ese criterio utilizado se mostró inadecuado, pues, en la mayoría de los casos, la cantidad de monómeros que serían obtenidos por la biosíntesis de ácidos grasos (con base en la cantidad de 3HDd∆5 detectado) fue superior al total de monómeros detectados por la cromatografía gaseosa. En otras palabras, la síntesis de monómeros a partir de la biosíntesis de ácidos grasos no ocurre de la misma forma en la síntesis de PHA a partir de aceites vegetales que cuando una fuente de carbono que utiliza exclusivamente esa vía metabólica es suministrada; de esta forma, no fue posible establecer la contribución de cada una de las vías metabólicas (β-oxidación y síntesis de novo de ácidos grasos)

En las tablas 7 y 8 se puede observar la incorporación de 3HDd∆6 por los dos

linajes estudiados. Con estas tablas se puede inferir que la ruta de la β-oxidación

contribuyó en la formación de monómeros, puesto que, este monómero es obtenido exclusivamente a través de esta vía metabólica (Tabla 1). El porcentaje de conversión de este ácido a 3HDd∆6 alcanzó un máximo de %YP/S de 28%.

Esto indica que la mayor cantidad de ácido linoléico fue metabolizado eficientemente por la β-oxidación, no permitiendo de esta manera su

incorporación como 3HDd∆6; el porcentaje de conversión del ácido linoléico a

este monómero fue mucho menor por el linaje IPT171 (Tabla 8), lo que pudo ser causado por el descenso del pH en el medio de cultivo, lo cual debió haber impedido la metabolización eficiente de ese substrato por ese linaje bacteriano

Tabla 7: Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas putida IPT 046 a partir de ácido

linoléico

%YP/S: Porcentaje del Rendimiento producto-sustrato Aceite Vegetal y/o

Mezcla Ac. Linoleico (µµµµmol/L) 3HDd∆∆∆∆6 (µµµµmol/L) %YP/S Algodón 15917,02 1183,35 7,43 Arroz50/Maiz50 13102,04 1331,04 10,16 Arroz 11506,88 755,16 6,56 Canola 14819,46 324,31 2,19 Coco 940,97 144,86 15,40 Girasol80/Soya20 17631,77 2629,76 14,91 Girasol 18069,14 727,34 4,03 Linaza25/Algodón75 14758,72 2536,04 17,18 Linaza40/Algodón60 14063,73 3315,79 23,58 Linaza50/Algodón50 13600,41 3208,49 23,59 Linaza70/Algodón30 12673,76 3594,93 28,37 Linaza80Algodón20 12210,44 3109,19 25,46 Linaza 11283,79 1344,98 11,92 Mamona 0,00 152,90 0,00 Palma15/Canola85 13024,69 1526,00 11,72 Palma50/Soya50 9368,32 835,44 8,92 Palma80/Mamona20 2283,46 374,49 16,40 Palma 2854,33 315,04 11,04 Soya 15882,30 868,48 5,47 Tungue 5618,28 100,73 1,79 Maiz 14697,19 1166,71 7,94

Tabla 8: Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas aeruginosa IPT 171 a partir de ácido

linoléico

%YP/S: Porcentaje del Rendimiento producto-sustrato Aceite Vegetal y/o

Mezcla Ac. Linoleico (µµµµmol/L) 3HDd∆∆∆∆6 (µµµµmol/L) %YP/S Algodón 15917,02 80,81 0,51 Arroz50/Maiz50 13102,04 88,58 0,68 Arroz 11506,88 74,72 0,65 Canola 14819,46 90,45 0,61 Coco 940,97 0,00 0,00 Girasol80/Soya20 17631,77 121,69 0,69 Girasol 18069,14 102,83 0,57 Linaza25/Algodón75 14758,72 150,24 1,02 Linaza40/Algodón60 14063,73 132,39 0,94 Linaza50/Algodón50 13600,41 98,57 0,72 Linaza70/Algodón30 12673,76 109,75 0,87 Linaza80Algodón20 12210,44 124,87 1,02 Linaza 11283,79 44,90 0,40 Mamona N.D 18,26 N.D Palma15/Canola85 13024,69 66,20 0,51 Palma50/Soya50 9368,32 64,25 0,69 Palma80/Mamona20 2283,46 22,15 0,97 Palma 2854,33 45,60 1,60 Soya 15882,30 65,77 0,41 Tungue 5618,28 69,68 1,24

7. CONCLUSIONES

• Aceites vegetales con diferentes composiciones de ácidos grasos fueron suministrados tanto paraP. aeruginosa IPT171 como para P. putida IPT046.

Se verificó que la composición del PHA depende tanto de la especie bacteriana como de los ácidos grasos proporcionados.

• Se corroboró que el linaje P. putida IPT 046 es mas eficiente en la

acumulación de PHA, alcanzando un 62% del monómero en la biomasa generada, comparado con el linaje P. aeruginosa IPT 171, que alcanzó hasta

un 20%; se determinó también que el pH es un factor importante en la actividad enzimática de los linajes estudiados y por ende en la formación del PHA, puesto que el linaje IPT 171 acidificó en mayor cantidad el medio y produjo menos PHA, comparado con el linaje IPT 046

• En la síntesis de 3HDd∆6, se observó una correlación linear entre la cantidad de ácido linoleico abastecida y la fracción molar acumulada de este monómero. Sin embargo, menos que 28% de este acido fue efectivamente incorporado en forma de este monómero, indicando un bajo potencial en la incorporación de 3HDd∆6 por el sistema de biosíntesis de PHA de las dos bacterias evaluadas.

• Se determinó que en los dos linajes bacterianos se usaron las dos vías metabólicas para la formación de monómeros constituyentes del PHA, cuando son cultivados en diversos ácidos grasos; la síntesis de novo de

ácidos grasos se detectó por la cantidad de 3HDd∆5 detectado, y la presencia de la β-oxidación por la existencia de 3HDd∆6.

• A pesar de las divergencias entre las concentraciones de ácidos grasos detectadas y las esperadas de acuerdo con la literatura, la matriz fue parcialmente usada, como una extrapolación de los posibles resultados obtenidos; esto pudo observarse al analizar la cantidad de ácido linoléico que fue incorporada al polímero en forma de 3HDd∆6, y en la cantidad de ácido α- eleosteárico convertido a 3HDd∆5,7, aunque determinados ácidos grasos no produjeron los monómero o no fueron detectados, como en el caso del aceite de mamona.

• El modelo usado para detectar la presencia de monómeros provenientes de la biosíntesis de ácidos grasos no se adapta a las exigencias del ensayo anterior, puesto que se detectaron menores cantidades de monómeros producidos que los calculados.

• Se lograron producir monómeros con conformaciones especiales que pueden hacer factible la modificación química del polímero y su mejoramiento de las características físicas, puesto que los linajes empleados tomaron intermediarios de la β-oxidación para su incorporación, como cadenas con

dobles enlaces carbono-carbono; sin embargo, se notó una deficiencia en la incorporación de monómeros a partir del ácido ricinoléico presente en el aceite de mamona, probablemente a que fue metabolizado por otras vías que impidieron su incorporación a partir de la β-oxidación.

8. RECOMENDACIONES

• Se recomienda realizar una caracterización del PHA producido a partir de aceites vegetales que representen extremos diferentes, bien como puntos centrales, en su composición de ácidos grasos, para visualizar la formación de PHA con constitución monomérica diferente y más evidente.

• Se recomienda realizar un análisis de resonancia magnética junto con la cromatografía gaseosa, para lograr determinar con mayor exactitud los picos correspondientes a los monómeros con instauraciones.

• Se recomienda evaluar el modelo utilizado para la determinación de monómeros conformacionales provenientes de la biosíntesis de ácidos grasos, puesto que el usado presentaba valores teóricos mayores de estos monómeros que los detectados por cromatografía gaseosa.

• Se recomienda analizar la cantidad de aceite vegetal no consumido después del tiempo de fermentación, según el método descrito por Kahar et al. (2004), para evaluar la cantidad de aceite asimilada por el