ANÁLISIS DE HOMOLOGÍA FUNCIONAL DE VP3 CON LA PROTEÍNA E3 DE VAC

Debido a su actividad de unión al dsRNA y su efecto sobre la fosforilación de PKR, se sugirió la hipótesis de que VP3 podría ser funcionalmente homóloga a otras proteínas virales de unión a dsRNA responsables de la inhibición de la respuesta innata del hospedador, como son E3 de VACV (Chang y col. 1992) o NS1 del virus de la gripe (Tan y Katze 1998). Estudios previos han descrito que el virus WR/E3L, un mutante de deleción derivado de la cepa Western Reserve (WR) de VACV, que carece del gen E3L y no expresa el polipéptido E3, es incapaz de replicar en líneas celulares con niveles basales de PKR e interferón como HeLa o BSC40 (Beattie y col. 1996). La inserción de genes recombinantes que codifican proteínas de unión a dsRNA de distintos virus, como NS1 del virus de la gripe (Guerra y col. 2011), sigmaA del reovirus aviar (González-López y col. 2003), y NSP3 del rotavirus porcino (Langland y col. 1994), en el genoma de WR/E3L, da lugar a virus VACV recombinantes capaces de superar la restricción impuesta por la carencia del gen E3L.

Para comprobar si la inserción de VP3 en el genoma del virus WR/E3L podía dar lugar a un virus capaz de replicar en células no permisivas, la región codificante correspondiente al gen VP3 se clonó en el vector de transferencia pJR101 bajo el control de un promotor sintético VACV temprano/tardío. El plásmido resultante, pJR101/VP3, fue empleado para generar el VACV recombinante WR/E3LVP3 por transfección de células DF1 previamente infectadas con WR/E3L. Las células DF1 son fibroblastos embrionarios de pollo inmortalizados donde el virus WR/E3L puede replicar de forma eficiente a pesar de carecer del polipéptido E3. El virus recombinante WR/E3LVP3, que expresa el polipéptido VP3 fue seleccionado, crecido y titulado en células DF1. A continuación, se infectaron cultivos de células HeLa con el virus WR/E3LVP3 a una MOI de 5 PFU/célula. Como control del experimento se infectaron estas mismas células con el virus parental WR y con el mutante de deleción WR/E3L. A las 8 y 24 h.p.i., las células se marcaron metabólicamente con [35S]metionina para analizar el estado de la síntesis proteica o se recogieron los extractos celulares para realizar un análisis mediante WB.

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Tal y como se había descrito previamente (Chang y col. 1995), se observa una drástica inhibición de la síntesis proteica en las muestras infectadas con el virus defectivo WR/E3L desde las 8 h.p.i. y, en el análisis mediante WB llevado a cabo con un suero anti-actina, utilizado como control de carga, se observa que las muestras recogidas a las 24 h.p.i. carecen de cantidades detectables de proteína alguna. Por el contrario, las células infectadas con el virus WR o con WR/E3LVP3 se mantienen traduccionalmente activas a las 24 h.p.i. (Figura 11). En el análisis mediante WB llevado a cabo con sueros específicos para los polipéptidos E3 y VP3 se observa, como era de esperar, que el virus WR/E3LVP3 expresa la proteína VP3 pero carece de la proteína E3, confirmando así la identidad genética de este virus recombinante (Figura 11).

Figura 11. La expresión de VP3 restablece la capacidad del virus WR/E3L de crecer en cultivos de células HeLa. Cultivos de células HeLa se infectaron con los virus WR, WR/E3L o WR/E3LVP3 (5 PFU/célula para cada virus) A las 8 y 24 h.p.i., las células se incubaron con [35S] metionina durante 30 minutos, se recogieron los extractos celulares y se sometieron a SDS-PAGE y autorradiografía. La flecha negra indica la posición del polipéptido VP3. Estos mismos extractos celulares, tras el SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con sueros anti-E3, -VP3, -D13 y –actina. Este último se tomó como control de carga del experimento.

La detección mediante WB del polipéptido de expresión tardía, D13, de VACV en las muestras infectadas con el virus WR/E3LVP3 indica que este virus es capaz de completar un ciclo completo de replicación en células no permisivas para el virus parental WR/E3L. Estos resultados fueron posteriormente corroborados al observar que el virus WR/E3LVP3 ocasiona placas de lisis comparables a las del virus WR en cultivos de células HeLa, mientras que la infección con el virus WR/E3L no es capaz de inducir la formación de placas de lisis en esta línea celular (Fig. 12A).

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Figura 12. Replicación del virus recombinante WR/E3LVP3 en células HeLa. A. Formación de placas. Cultivos de células HeLa fueron cultivadas en placas de 6 pocillos e infectadas con diluciones seriadas

de los virus WR, WR/E3L y WR/E3LVP3. A las 48 h.p.i. se retiró el medio, las células se fijaron con formaldehido al 10% y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% en etanol 20%. B. Cinética de crecimiento. Cultivos de células HeLa se infectaron con WR, WR/E3L y WR/E3LVP3 (0.1 PFU/célula para cada virus). A los tiempos indicados (h.p.i.) se recogieron los extractos celulares y se utilizaron para determinar el título viral en cultivos de células aviares DF-1.

Para analizar la capacidad de este virus recombinante WR/E3LVP3 de replicar productivamente en células no permisivas, cultivos de células HeLa se infectaron a una MOI de 0.1 PFU/célula, se recogieron a las 24, 48 y 72 h.p.i. y se emplearon para determinar el título viral en células DF1. Como control del experimento, se realizaron infecciones y titulaciones con el virus WR y el mutante de deleción WR/E3L. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 12B, y demuestran que, en contraste con el virus WR/E3L, incapaz de crecer en células HeLa, el virus recombinante WR/E3LVP3 es capaz de replicar de forma eficiente en estas células alcanzando títulos similares a los observados en células infectadas con el virus WR. Estos resultados demuestran que la proteína VP3 de IBDV restablece la capacidad del virus WR/E3L de infectar de forma productiva cultivos de células HeLa.

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4.4. ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE LA PROTEÍNA VP3 COMO SUPRESORA DEL