5. RESULTADOS
5.2. Análisis de la secuencia y estructura de los vSLAM de SMCMV y OMCMV
En primer lugar se quiso caracterizar la estructura secundaria de los 7 vSLAM encontrados en CMV que infectan NWM. Con tal fin se emplearon diversas herramientas bioinformáticas y bases de datos. Así, utilizando los programas bioinformáticos SignalIP 4.1 y TMHMM 2.0 se predijeron las localizaciones del péptido señal y la región transmembrana, y consultando la base de datos CDD, como se ha descrito anteriormente, los dominios inmunoglobulina y la estructura secundaria de estos vSLAM. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteínas virales muestran la típica estructura de receptor de membrana de tipo Ig, con un péptido señal, dos dominios inmunoglobulina Ig1 e Ig2, un tallo, una región transmembrana y un cola citoplasmática. Con objeto de predecir los residuos N- y O- glicosilados de las regiones extracelulares de los vSLAM identificados, se emplearon los programas bioinformáticos NetNGlyc 1.0 y NetOGlyc 4.0, respectivamente. Se determinó que
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todas estas proteínas virales presentan un grado potencial de glicosilación mayor que sus respectivos receptores SLAM homólogos. Por último, se realizó una búsqueda de los motivos ITSM característicos de la cola citoplasmática de la mayoría de los receptores SLAM, observándose que todas estas proteínas virales carecen de ellos. A continuación profundizamos en el estudio de la secuencia y estructura de cada una de estas proteínas virales.
5.2.1. Estructura de S1, el homólogo de SLAMF6
La proteína S1 presente en SMCMV consta de 285 aminoácidos (aa). Posee un péptido señal de 26 aa, dos dominios inmunoglobulina Ig1 e Ig2 de 110 y 88 aa respectivamente, un tallo de 9 aa, una región transmembrana de 22 aa, y un cola citoplasmática de 30 residuos (Figura 14 A). S1 muestra una homología global de 62% con SLAMF6 de Saimiri boliviensis (sbSLAMF6), destacando una identidad casi completa en sus dos dominios Ig, siendo esta de un 97% en Ig1 y de un 93% en Ig2 (Figura 14 B). Mientras que los dominios Ig del receptor sbSLAMF6 contienen 6 potenciales sitios de N-glicosilación, en S1 podemos encontrar 8, además de uno de O-glicosilación. Por último, S1 presenta una cola citoplasmática mucho más corta que SLAMF6 y sin los motivos ITSM de señalización (Figura B y C).
Figura 14. Caracterización estructural de la proteína S1 del SMCMV.(A) Secuencia aminoacídica de la proteína S1 de SMCMV. El péptido señal está indicado en amarillo, el dominio Ig1 se encuentra en azul, el dominio Ig2 en verde, el tallo en gris, el dominio transmembrana en rosa y la cola citoplasmática sin color. Los potenciales sitios de N- glicosilación se encuentran subrayados, el sitio de O-glicosilación predicho está indicado en rojo y las cisteínas conservadas típicas de los dominios Ig se indican sombreadas gris oscuro. (B) Dominios proteicos de sbSLAMF6 y S1 y el tanto por ciento de identidad de cada uno de ellos. El péptido señal (SP), los dominios inmunoglobulina (Ig1, Ig2), la región transmembrana (TM) y la cola citoplasmática (CT) se muestran empleando el mismo código de colores descrito en A. El tallo no se representa debido a su pequeña longitud. Los triángulos negros dentro de las CT representan motivos ITSM. Las líneas azules y rojas debajo de cada proteína marcan los sitios de N- y O-glicosilación
MATWGGGDGTYCLLPGLLLLFRVGPGGPVSQTSSTPLIVNGV LGESVTLPLEFPAGEKIKSITWHYNGTSIAFIAPSEAKSPQI HLTNPKLGKRLNFTQSYSLQLSNLEMEDTGSYSALMSSETTV NVSSYTLRIFRKLKNIQVSNHSQLSQNRICEIHLTCSVEDPN DNISFKWEALGKTLLREPNLTTSWDPRNSSEQNYTCIAENAV SNLSFTVSAQKLCEVAYMSTEARMLVAALMTCLVIICLLGLF LVWKRRRAGSLLCIQLCFSHLFSREHQAETLIF
A
B
C
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predichos, respectivamente. La región transmembrana y la cola citoplasmática de SLAMF6 se encuentran punteadas debido a que se corresponden con SLAMF6 de Calithrix jacchus, al desconocerse esa parte de la secuencia en el genoma de Saimiri boliviensis. (C) Representación esquemática de la proteína S1 y su homólogo celular sbSLAMF6. Se muestran los potenciales sitios de N- y O-glicosilación, los motivos ITSM y los puentes disulfuro de los dominios Ig (líneas punteadas).
5.2.2. Estructura de A33, el homólogo de LY9
La proteína de OMCMV, A33, está constituida por 296 aa. Tal y como se puede observar en la Figura 15 A, A33 contiene un péptido señal de 29 aa, dos dominios inmunoglobulina Ig1 e Ig2 de 136 y 84 aa respectivamente, un tallo de 10 aa, una región transmembrana de 22 residuos, y una cola citoplasmática de 15 aa. El dominio Ig1 de A33 muestra una elevada identidad (77%) con el dominio Ig V-like N-terminal de LY9 de Aotus nancymae (anLY9) que participa en la interacción homofílica de este receptor (Figura 15 B). Una característica destacable de esta proteína viral es la presencia de dos dominios Ig en lugar de los 4 dominios Ig característicos de la molécula LY9. El dominio Ig2 está constituido por el inicio del dominio Ig C2-like 2 y el final del dominio Ig C2-like 4 de LY9. También hemos predicho 13 sitios potenciales de N-glicosilación y uno de O-glicosilación en los dominios Ig de A33, en lugar de los 5 N-glicosilaciones de los dos dominios Ig N-terminales de anLY9. Por último comentar que la cola citoplasmática de A33 es considerablemente más reducida que la de anLY9 y, al igual que S1, carece de motivos ITSM (Figura 15 B y C).
A
B
MSSSISVCRPLHGSDWTFQSTYCSQSCRAVNRREGQSSHRNGV VPGGAGCRAGQKPRAHAPKNCLAHTEVIGSVGGFASFPLNISN ATDIENVAWNGPKIALAFANPKDVTIMDKSYQGRVNISQTNYS LCIRNLTVNDAGSYKAQINKNNSQVTTKEEFTLSVFEQLQEPK VTLLYVNQSSFNKCNVTLQCSVGGTENNVTYSWMPTQNGKSIL FATYPGVNETYNCTVKNPVSTNTSKNIVPARFCSYALPTSSST HLTIVLPLVTCFTCVGILCWWCFGKQYLRMFRFNCPARC
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Figura 15. Caracterización estructural de la proteína A33 de OMCMV.(A) Secuencia aminoacídica de la proteína A33 de OMCMV. El péptido señal está indicado en amarillo, el dominio Ig1 se encuentra en azul, el dominio Ig2 en verde, el tallo en gris, el dominio transmembrana en rosa y la cola citoplasmática sin color. Los potenciales sitios de N- glicosilación se encuentran subrayados, el sitio de O-glicosilación predicho está indicado en rojo y las cisteínas conservadas típicas de los dominios Ig se indican sombreadas en gris oscuro. (B) Dominios proteicos de anLY9 y A33 y el tanto por ciento de identidad de cada uno de ellos. El péptido señal (SP), los dominios inmunoglobulina (Ig1, Ig2, Ig3 e Ig4), la región transmembrana (TM) y la cola citoplasmática (CT) se muestran empleando el mismo código de colores descrito en A. El tallo no se representa debido a su pequeña longitud. Los triángulos negros dentro de las CT representan motivos ITSM. Las líneas azules y rojas debajo de cada proteína marcan los sitios de N- y O-glicosilación predichos, respectivamente. (C) Representación esquemática de la proteína A33 y su homólogo celular anLY9. Se muestran los potenciales sitios de N- y O-glicosilación, los motivos ITSM y los puentes disulfuro de los dominios Ig (líneas punteadas).
Debido a que se desconoce la secuencia del receptor LY9 del huésped de OMCMV, Aotus trivirgatus (atLY9) obtuvimos la secuencia de sus dos primeros dominios Ig a partir del ADN extraído de la línea celular epitelial OMK del propio primate. Observamos que la homología del dominio Ig1 de atLY9 con respecto a A33 aumentaba hasta un 80% en lugar del 77% observado para anLY9.
5.2.3. Estructura de A43, A44, A45, S30 y S31, los homólogos de CD48
Tal y como se ha comentado previamente, identificamos 5 homólogos de CD48 (vCD48), tres en OMCMV, A43, A44 y A45, y dos en SMCMV, S30 y S31. Estos vCD48 son difieren en cuanto a tamaño, A43, A44 y S30 están constituidos por 279, 275 y 245 aa, mientras que A45 y S31 son más grandes, de 413 y 358 aa respectivamente (Figura 16 A). En general, observamos una tendencia a un mayor número de N-glicosilaciones en estas proteínas virales respecto a sus homólogos SLAM, y además, cabe resaltar que S31 y A45 presentan tallos largos de nueva generación que contienen abundantes residuos de treoninas y serinas, con un elevado grado de O-glicosilación. Otra característica a destacar única de estos vCD48 es que presentan una región transmembrana, en lugar del anclaje GPI propio de CD48. Por último, tres de ellos, A43, A45 y S31, presentan colas citoplasmáticas de una longitud de alrededor de 25 aa, mientras que A44 y S30 carecen de la misma (Figura 16 A y B).
Entre los vCD48 destacamos A43, ya que es el que presenta un mayor porcentaje de identidad (86%) en el dominio Ig1 con respecto al dominio Ig V-like N-terminal de anCD48. Tal y como se muestra en la Figura 16 C, A43 es una proteína viral de 279 aa que consta de un péptido señal de 24 aa, unos dominios Ig1 e Ig2 de 99 y 87 aa, un tallo corto de 13 residuos, una región transmembrana de 23 aa y una cola citoplasmática de 31. A43 presenta 9 potenciales sitios de N-glicosilación en lugar de los tres sitios de N-glicosilación predichos para anCD48. Las secuencias proteicas del S30, S31, A44 y A45 y las distintas regiones que presentan se encuentran en el anexo 2. Por último, de la misma forma que para LY9, obtuvimos las secuencias de los dos dominios Ig de CD48 de Aotus trivirgatus (atCD48)
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mediante secuenciación de los exones de esta molécula y utilizando para ello el ADN extraído de células OMK, observando que A43 presenta un 91% de homología con atCD48.
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Figura 16. Caracterización estructural de los vCD48 de OMCMV y SMCMV. (A) Dominios proteicos de anCD48 y
CD48 de Saimiri boliviensis (sbCD48), y sus homólogos en OMCMV y SMCMV con el tanto por ciento de identidad de cada uno de ellos. El péptido señal (SP) se señala en amarillo, los dominios inmunoglobulina (Ig1, Ig2) en azul o verde, el tallo en S31 y A45 en gris, la región transmembrana (TM) en naranja, la cola citoplasmática (CT) en blanco, y el anclaje GPI de los CD48 en rojo. Los triángulos negros dentro de las CT representan motivos ITSM. Las líneas azules y rojas debajo de cada proteína marcan los sitios de N- y O-glicosilación predichos, respectivamente. (B) Representación esquemática de las proteínas A43, A44, A45, S30 y S31, y su homólogo celular CD48. Se muestran los potenciales sitios de N- y O-glicosilación (para mayor claridad, en los tallos de S31 y A45 solo se muestran una parte de las O-
A
B
MNNSYLWLPVSLGLITLSLLRVGGDSVNIVNALVGGNITLNISESLP ENVREITWFCTYDQKIADWDVKRLKYFDNKFKGRVRLDSQSGALYLS RVQKEDANIYIMRVLKDTMFEQDWKIRLQVFDEVDTPNITLVNTTLI SDTCYVNFSCSHHDSLCYTSNENCTWYHFSQNITKTPPWNHSASSNS CYTCEFKNPVHRKNITMCISGCGQTGIKALATRSPRRYAITFIVMIL VAVLCTLSYCAYTYGVRDAMSCTFGAFIGFRARFSTLRYLLWQLC
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glicosilaciones predichas) y los puentes disulfuro de los dominios Ig (líneas punteadas). (C) Secuencia aminoacídica de la proteína A43 de OMCMV. El código de colores empleado para cada región de la secuencia de A43 es el mismo que en A, a excepción del tallo que se indica en gris. Los potenciales sitios de N-glicosilación se encuentran subrayados y las cisteínas conservadas típicas de los dominios Ig se indican sombreadas en gris oscuro.