ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

Se utilizaron 144 ratas machos de la línea Wistar de 160 ± 20 gramos de peso y de 45 a 50 días de edad aproximadamente. Los animales fueron adquiridos y mantenidos en Bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas de la U.N.C. Permanecieron en jaulas individuales, en condiciones de luz-oscuridad con ciclos de 12-12 horas, a una temperatura de 22-26 º C y humedad relativa del 60%. La dieta utilizada fue alimento balanceado para animales de laboratorio, Rata-Ratón Laboratorio® de Gepsa, y agua de bebida filtrada PSA® ad libitum, durante el tiempo que duró el experimento.

El manejo de los animales fue realizado siguiendo los lineamientos del National Institute of Health (NIH) para el uso y cuidado de animales de experimentación, y se adecuó a las normas propuestas por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Médicas U.N.C. en concordancia con NIH.

Al inicio del experimento los animales fueron anestesiados con una solución de ketamina/xilazina en relación 8 mg/1.28mg respectivamente por cada 100 g de peso corporal. Previa asepsia del campo quirúrgico con yodopovidona, se realizó con bisturí Bard Parker y hoja Nº 15 una incisión longitudinal en cada miembro posterior y se procedió al decolado hasta llegar a exponer el hueso de la tibia. Con una fresa número 6 y a rotación manual, para no producir necrosis ósea, se realizó una cavidad sobre la parte plana de la cara anterior de cada tibia. Dichas cavidades no fueron rellenadas con ningún material y sólo fueron reparadas por sus propios coágulos. Luego de realizadas las intervenciones quirúrgicas, se recolocaron los planos en posición y se suturó la herida con hilo reabsorbible.

Los animales fueron tratados según normas universales de asepsia. Al finalizar el experimento se sometieron a eutanasia mediante inyección intracardíaca de cloruro de potasio, bajo anestesia general.

Los animales se dividieron en 6 grupos de tratamientos: control (C), alendronato (AL), pamidronato (PA), aceite de oliva (O), alendronato+aceite de oliva (ALO), pamidronato+aceite oliva (PAO), de 4 ratas cada uno, utilizando en total 24 animales por grupo. Estos a su vez, fueron distribuidos en 6 tiempos: 0, 7, 15, 30, 60, 90 días. Teniendo en cada grupo y en cada tiempo 4 animales.

CRISTINA ESCUDERO CANTCHEFF 51 Un grupo actuó como grupo control (C). Las ratas de este grupo recibieron semanalmente 0,3 ml/100 g de peso corporal de solución salina por vía subcutánea cercana a la intervención quirúrgica.

El segundo grupo (AL) recibió semanalmente 0,5 mg de AL/Kg de peso corporal por vía subcutánea profunda en el miembro posterior izquierdo cercano a la zona quirúrgica, y en el miembro posterior derecho se le aplicó solución salina como el grupo control.

El tercer grupo (PA) recibió semanalmente 0,6 mg de PA/Kg de peso corporal por vía subcutánea profunda en el miembro posterior izquierdo cercano a la zona quirúrgica, y en el miembro posterior derecho se suministró solución salina como el grupo control.

El cuarto grupo (O), recibió tratamiento con aceite de oliva, siendo alimentados ad libitum, con una ración de entre 30 y 40 gramos de alimento por día por rata, el cual se embebió previamente con el aceite de oliva en la proporción correspondiente, (50 g/Kg de comida), durante el tiempo que duró el experimento. Cabe aclarar que se tuvo en cuenta que el alimento proporcionado fuera consumido en su totalidad al final del día. En las áreas de las cirugías, los animales de este lote O, recibieron inyección subcutánea de solución salina como el grupo control.

El quinto grupo de tratamiento (ALO) recibió en forma conjunta AL subcutáneo y O por vía oral en la dieta.

El sexto grupo (PAO) recibió tratamiento con PA subcutáneo y O por vía oral en la dieta. Se efectuaron determinaciones a los días 0, 7, 15, 30, 60, 90 de iniciados los tratamientos, utilizando 4 ratas en cada tiempo, a las que se les administró la solución salina, el AL y el PA cada 7 días; y en forma continua el aceite de oliva al cuarto, quinto y sexto grupo.

En todos los tiempos experimentales se tomaron radiografías de ambas tibias. Posteriormente estas tibias fueron colocadas en frascos estériles y fijadas en formaldehído al 10 % para ser descalcificadas e incluidas en parafina. Sobre estas muestras se realizaron cortes histológicos a nivel de las cavidades quirúrgicas y hueso circundante. Los cortes obtenidos fueron coloreados con Hematoxilina/Eosina (H/E) para el análisis histopatológico e histomorfométrico correspondiente.

CRISTINA ESCUDERO CANTCHEFF 52 El día de sacrificio de los animales, se obtuvieron también ambos fémures para los estudios biomecánicos.

En los tiempos experimentales 7, 15, 30, 60 y 90 días se extrajo sangre por punción cardíaca para determinación de fosfatasa alcalina. Vale aclarar que no se sacrificaron animales en el tiempo 0 para este estudio bioquímico, ya que resultaría innecesario tomar muestras al cabo de finalizada la cirugía, siendo que las variaciones bioquímicas en cuanto a FA, adquieren valor significativo a partir del séptimo día de producida la injuria. (143-144-145).

Protocolo de trabajo. Rx: obtención de radiografías, PC: obtención de muestra de sangre por punción cardíaca, +: eutanasia.

GRUPO DÍAS 0 7 15 30 60 90 C Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx AL Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx PA Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx O Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †PC,Rx ALO Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx PAO Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx †,PC,Rx

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