B.1 Notas referentes al procedimiento
El usuario debe leer estas instrucciones atentamente y familiarizarse con todos los
componentes y los instrumentos antes de la utilización (véase el apartado “Precauciones”). Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20–25 °C) antes de la inmunotinción. De forma similar, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente.
No permita que los cortes de tejido se sequen durante la carga de portaobjetos en el
Autostainer ni durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido secos pueden mostrar una mayor tinción no específica.
Si se interrumpe el procedimiento de tinción, los portaobjetos pueden conservarse en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo primario como máximo una hora a
temperatura ambiente (20–25 °C) sin que afecte al r endimiento de la tinción.
Desparafinado y rehidratación: antes de la tinción, los portaobjetos con los tejidos deben
desparafinarse, para eliminar el medio de inclusión, y rehidratarse. Evite una retirada
incompleta de la parafina. Cualquier residuo del medio de inclusión provocaría un aumento de la tinción no específica. Este paso debe realizarse a temperatura ambiente (20–25 °C).
1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez.
2. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos e introdúzcalos en etanol absoluto durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez.
3. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en etanol al 95% durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez.
4. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos e introdúzcalos en agua destilada o desionizada un mínimo de 30 segundos. Inicie el proceso de tinción tal y como se expone en el paso 1 “Recuperación de epítopo” de la sección B.2.
Las soluciones de xileno y alcohol deben cambiarse después de 40 portaobjetos. En lugar de xileno, pueden utilizarse sustitutos de tolueno o xileno, como Histoclear.
NOTA: los reactivos y las instrucciones suministradas en este kit han sido diseñados para una
eficacia óptima. Una mayor dilución de los reactivos o la alteración de las temperaturas de incubación puede conducir a resultados erróneos o discordantes. Las diferencias en el procesamiento de tejidos y los procedimientos técnicos en el laboratorio del usuario pueden invalidar los resultados del ensayo para su utilización en la selección de pacientes para la terapia de Herceptin™.
B.2 Protocolo de tinción
Realizado a temperatura ambiente, 20–25 °C. Paso 1: Recuperación de epítopo
Llene los recipientes de tinción, por ejemplo, cubetas de Coplin, con la Epitope Retrieval Solution diluida (consulte las INSTRUCCIONES DE USO en la sección A.1). Coloque los recipientes de tinción con Epitope Retrieval Solution en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Epitope Retrieval Solution a una temperatura de 95–99 °C. La Epitope Retrieval Solution adquiere un aspecto turbio al calentarla. Cubra los recipientes con tapas para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación.
Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Epitope Retrieval Solution precalentada de los recipientes de tinción. VUELVA A SITUAR LA
TEMPERATURA DEL BAÑO DE AGUA Y LA EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION DE NUEVO A 95–99 °°°°C. Incúbela durante 40 (±1) minutos a 95–99 °C.
Saque la jarra entera con los portaobjetos del baño de agua. Deje que los portaobjetos se enfríen en la Epitope Retrieval Solution durante 20 (±1) minutos a temperatura ambiente. Decante la Epitope Retrieval Solution y aclare los portaobjetos en el Wash Buffer (consulte las INSTRUCCIONES DE USO de la sección A.2).
Para un rendimiento óptimo, empape los cortes en Wash Buffer entre 5 y 20 minutos después de la recuperación de epítopo y antes de la tinción.
NOTA: la Epitope Retrieval Solution está pensada para una aplicación de un solo uso.
No la reutilice.
Paso 2: Procedimiento del Autostainer
1. Utilice el mapa generado con el Autostainer sobre el autoprograma de HercepTestTM
para establecer los tiempos de programa y los volúmenes de reactivo necesarios (consulte el punto 4 para conocer los volúmenes específicos). 2. Coloque los viales de reactivo del Autostainer en la rejilla de reactivos del
Autostainer según indica el mapa de reactivos generado por ordenador.
3. Cargue los portaobjetos en el Autostainer según indica el mapa de portaobjetos generado por ordenador.
4. Seleccione Program e inicie el programa de HercepTestTM
: Lo que sigue a continuación es un esquema de la secuencia del programa:
Aclarado
200 µL Peroxidase-Blocking Reagent - 5 minutos
Aclarado
200 µL Primary Anti-HER2 Protein (o Negative Control Reagent) - 30 minutos
Aclarado
200 µL Visualization Reagent - 30 minutos
Aclarado
Aclarado
Cambio
200 µL Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 minutos
Después del paso con sustrato cromógeno, aclare los portaobjetos con agua desionizada.
NOTA: el Autostainer Hardware versión 01 aclara los portaobjetos con tampón.
Por tanto, una vez retirados los portaobjetos del Autostainer, deben aclararse con agua desionizada.
Paso 3: Contratinción (instrucciones válidas para la hematoxilina)
Retire los portaobjetos del Autostainer y realice la contratinción con hematoxilina como se describe a continuación.
Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina. Incúbelos entre 2 y 5 minutos, en función de la potencia de la hematoxilina utilizada.
Aclárelos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada. Asegúrese de que se han eliminado todos los residuos de hematoxilina.
Opcional: introduzca los portaobjetos 10 veces en un baño de agua de amoníaco a 37 mmol/L (véase la sección A.4).
NOTA: en función de la duración de la incubación y la potencia de la hematoxilina
utilizada, la contratinción dará como resultado una coloración entre azul pálido y azul oscuro de los núcleos celulares. Una contratinción excesiva o incompleta puede invalidar la interpretación correcta de los resultados.
Paso 4: Montaje
Se recomienda un medio de montaje no acuoso y permanente. De todas formas, un medio de montaje acuoso también resulta aceptable. Los especímenes pueden montarse y taparse con cubreobjetos con un medio de montaje acuoso como DakoCytomation Faramount, N.º de catálogo S3025, o Glycergel™, N.º de catálogo C0563.
NOTA: los portaobjetos pueden leerse cuando resulte apropiado. No obstante, puede
que se pierda el color si los portaobjetos se cubren con un medio de montaje acuoso y se exponen a una luz intensa durante una semana. Para minimizar la pérdida de tinte, almacene los portaobjetos en un lugar oscuro a temperatura ambiente (20–25 °C).