Bioactividad

La capacidad de un material para enlazarse con el tejido óseo es un fenómeno conocido como bioactividad y se evalúa rutinariamente verificando si el material es capaz de inducir la formación de una capa de hidroxiapatita en su superficie cuando se lo sumerge en suero fisiológico simulado, una solución cuya concentración iónica es prácticamente equivalente a la del plasma sanguíneo[25]. En esta sección la examinación de la formación de una capa de hidroxiapatita sobre la superficie de los materiales expuestos a SBF se realizó mediante inspección con microscopía electrónica de barrido. La figura 5.2 muestra imágenes representativas de los resultados obtenidos luego de la inmersión en SBF durante 1, 6 y 10 días, imágenes de los materiales antes del tratamiento (día 0) se muestran con fines comparativos. En los tres materiales puede observarse la formación de depósitos de aspecto esférico sobre su superficie; el microanálisis por EDX realizado sobre estos depósitos revela que están compuestos principalmente por calcio, fósforo y oxígeno, donde la relación atómica Ca/P es muy cercana a la de la hidroxiapatita estequiométrica (Ca/P ≈ 1,67), figura 5.3.

En condiciones fisiológicas, el fluido extracelular no se encuentra suficientemente supersaturado respecto de hidroxiapatita, por lo que el mineral no precipita espontáneamente; para lograr la mineralización ósea, osteoblastos y condrocitos actúan en conjunto formando vesículas de matriz extracelular que sirven como microambiente en el cual los iones calcio y fosfato pueden aumentar su concentración de manera suficiente como para inducir la precipitación de los cristales de HAp[8]. Muchos autores recomiendan la utilización de SBF 1X en el estudio de la bioactividad de materiales[3], [27], [28], sin embargo esto podría dar lugar a la obtención de resultados falsos

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negativos (esto es, categorizar a un material como no bioactivo por no ser capaz de inducir la precipitación in vitro de HAp cuando en realidad sí puede unirse al tejido óseo en modelos in vivo, tal y como se observa en ciertos carbonatos de calcio o β-fosfato tricálcicos[26]). En virtud de lograr un modelo experimental más cercano a lo que ocurre durante la mineralización ósea en sistemas biológicos, se decidió emplear un suero fisiológico simulado cuya concentración iónica es 1,5 veces superior a la del plasma sanguíneo.

A

B

C

Tiempo (días)

0

1

6

10

Figura 5.2: Microfotografías electrónicas (SEM) de los materiales y sus depósitos de HAp formados luego de 1, 6 y 10 días de incubación en SBF a 37°C.

Sería posible criticar la selección de estas condiciones experimentales argumentando que el sistema SBF 1,5X está sobresaturado respecto de apatita, que es metaestable y que es cuestión de tiempo para que evolucione hacia el equilibrio termodinámico induciendo la precipitación espontánea de cristales de apatita[7], [29]. Es por ello que se utilizó un control de bioactividad negativo, esto es, una muestra de anatasa comercial (AA) cuya ausencia de bioactividad fue confirmada por otros autores[30] y también en repetidas oportunidades en nuestro laboratorio utilizando SBF 1X y SBF 1,5X. La figura 5.4 muestra las microfotografías electrónicas de esta muestra antes y después de la inmersión durante 30 días en SBF 1,5X, observándose la ausencia de precipitados de fosfatos de calcio, lo cual permite verificar que la presencia de los depósitos minerales observados en los materiales A, B y C, no es producto directo de la inestabilidad termodinámica del suero fisiológico simulado.

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Mate

rial A

Mate

rial B

Mate

rial C

Figura 5.3: Microanálisis por dispersión de energías de rayos X (EDX) de la capa de HAp desarrollada en los materiales A, B y C luego de 10 días de inmersión en SBF a 37 °C, con sus respectivas relaciones atómicas Ca/P.

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(a) (b)

Figura 5.4: Microfotografías electrónicas (SEM) de una muestra de anatasa comercial (AA) (a) antes y (b) luego de 30 días de incubación en SBF 1,5X a 37 °C.

En general, las teorías concernientes a la bioactividad del TiO2 cristalino están aún en etapa

de desarrollo. El consenso general es que el óxido de titanio es bioactivo debido a la presencia de grupos oxhidrilo (—OH) que se forman en la superficie del material luego de su inmersión en SBF. Son estos grupos —OH los que catalizan la precipitación de hidroxiapatita. Uchida et al.[31] estudiaron el crecimiento de HAp en superficies de TiO2 que presentaban diferentes estructuras

cristalinas y elaboraron una teoría que explicaría por qué los grupos —OH correspondientes a titania amorfa parecerían menos efectivos que los presentes en rutilo o anatasa a la hora de estimular la deposición de estos cristales de fosfatos de calcio. Ellos sugieren que para ciertos planos cristalográficos en las estructuras de TiO2, las posiciones de los átomos de oxígeno se solapan

convenientemente con los grupos —OH de la HAp, favoreciendo una nucleación epitaxial. Es esperable que crecimiento epitaxial de HAp esté favorecido sobre rutilo debido a similitudes bidimensionales en ambas estructuras cristalinas[32]. En contraste, y de acuerdo con Li et al.[30], la HAp biomimética no puede formarse sobre monocristales de anatasa, figura 5.4; una de las razones que los autores plantean es que la densidad de grupos —OH no es lo suficientemente alta en el plano cristalino adecuado. Ellos también notaron que mientras cristales individuales de anatasa densamente empaquetada carecían de bioactividad, los de anatasa porosa sí inducían la deposición de apatita. En general, se cree que una estructura porosa es capaz de acelerar el proceso biomimético[33].

Los materiales obtenidos en el presente trabajo (A, B y C) mostraron ser bioactivos, independientemente de su estructura cristalina y del hecho de que no presentan grandes áreas superficiales ni arreglos ordenados de mesoporos, tabla 4.2. En consecuencia, los resultados aquí

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obtenidos demuestran que tanto las diferencias en el polimorfismo cristalino como la porosidad no son suficientes para inducir y/o explicar la bioactividad.

Tabla 4.2: características fisicoquímicas del recubrimiento de fosfato de calcio en los materiales luego de 10 días de incubación en SBF.

Morfología Ca/P Rq (nm) Ra (nm) Rsk Rku

TiO2 Capa densa aplanada 1,63 70,87 61,58 1,41 2,27

Ce-TiO2 Capa esferulítica 1,62 60,09 45,43 1,80 3,97

CeO2-TiO2 Capa esferulítica 1,60 50,77 41,47 1,55 2,86

Antes de que ocurran las reacciones bioquímicas que dan lugar al comportamiento bioactivo, ciertos procesos fisicoquímicos deben ser termodinámicamente posibles. La textura superficial tiene injerencia directa sobre la energía superficial, la cual, oportunamente, afecta la biorreactividad[34]. Debido a que la formación de HAp sobre TiO2 en soluciones acuosas sobresaturadas es un proceso de

nucleación heterogéneo, de acuerdo con la teoría de nucleación clásica, la energía libre crítica (ΔG) depende de la sobresaturación de la solución (S), de la temperatura (T), de la energía de nucleación interfacial neta (σ) y del área superficial de la partícula (A), de acuerdo con la siguiente ecuación[34]:

ΔG = - RT ln(S) + σA (5.1)

En este trabajo, los materiales fueron sumergidos en la solución de SBF a temperatura y con sobresaturación respecto de HAp constantes; asimismo no se observan mayores diferencias respecto a las áreas superficiales de los precipitados. La única variación existente entre ellos es la barrera de energía interfacial neta dada por el parámetro (σ), que es altamente dependiente tanto de la topografía superficial como de la presencia, en la interfase, de los componentes altamente polares[34], [35]. En consecuencia, se cree aquí que la nucleación heterogénea de la HAp está activamente influenciada por la energía superficial y la topografía de los materiales: en superficies rugosas, como es el caso de estos materiales, los valles parecen ser los sitios preferenciales para la nucleación y crecimiento de los fosfatos de calcio, causando una reducción del parámetro Ra. De la

misma manera, superficies con asimetría positiva favorecen la deposición de fases ricas en calcio. El análisis topográfico indica que los materiales B y C, que presentan el mayor número de valles, inducen un mayor y más rápido recubrimiento de su superficie con cristales de HAp. Es relevante destacar que los aglomerados de HAp alteran la topografía original del material, figura 5.2 (tabla 5.2 y tabla 4.3, capítulo 4), disminuyendo la rugosidad a nivel nanométrico.

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Las capas de hidroxiapatita que se formaron sobre los materiales poseen apariencias fundamentalmente diferentes, como puede apreciarse en la figura 5.5. Los cristales de HAp que cubren la superficie del material A (TiO2) crecen como una densa capa de cristalitos en forma de

disco que crecen lado a lado, mientras que los que se desarrollan sobre el material B (Ce-TiO2)

aparecen en forma de racimos de esferas. En este trabajo se asume que estas diferencias están relacionadas con un crecimiento preferencial de los cristales de HAp respecto de las fases cristalinas del dióxido de titanio. De esta manera, en el material A, el crecimiento preferencial ocurre de forma paralela a la superficie, posiblemente debido a la interacción con el plano (001) del rutilo superficial[36]. En contraste, si el crecimiento epitaxial es preferencial sobre la superficie correspondiente al plano (110) de anatasa[35], [36] (figura 5.6), como sucede en los materiales B y C, los depósitos de HAp forman glóbulos o rosetas, de 3-5 µm de diámetro, compuestos de aglomerados de cristalitos discoidales de ≈ 150 nm de longitud.

Figura 5.5: Microfotografías electrónicas de los depósitos de HAp en el material A (compuesto por rutilo y anatasa) y el material B (anatasa pura) luego de 10 días de incubación en 1,5 SBF a 37 °C.

Figura 5.6: Puntos de coincidencia en las redes cristalinas para los planos (a) (001)R/(0001)HAp y

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Es interesante destacar que partículas esféricas con forma de pétalos en la capa de fosfatos de calcio que se forma sobre la superficie del material, como las observadas en B y C, están asociadas con una mayor velocidad de formación ósea sobre implantes[37] y una mayor adhesión de células osteogénicas debido a un aumento en la superficie y rugosidad del sustrato[28].