El método analítico propuesto para la cuantificación de naproxeno sódico en tableta de 550 mg mediante espectrofotometría ultravioleta actualmente no figura en ninguna obra oficial, por lo tanto al no estar registrado o completado en alguna farmacopea, debe ser validado previamente a su uso en rutina, con el fin de proporcionar un alto grado de confianza, seguridad y calidad de los resultados, lo cual se traduce en disminución de errores y repeticiones del análisis.10, 19
La validación de un método analítico debe iniciarse con el análisis de selectividad o especificidad, ya que este parámetro nos demuestra que el método es capaz de discriminar entre el analito, sustancias de composición similar y otras sustancias que puedan estar presentes en la muestra, como excipientes o productos de degradación. Teniendo en cuenta que el análisis de muestras de un analito pueden ser sometidas a condiciones de degradación artificial hasta en un 20% y que esto constituye un criterio de especial interés cuando se desconoce sus productos de degradación. Por ello se analizaron muestras de un lote de tabletas de naproxeno sódico en diluciones al 80%, 100% y 120% las cuales fueron sometidas a irradiación ultravioleta por 24 horas, y luego analizadas estadísticamente tomando en cuenta que la selectividad de manera análoga a la exactitud, se expresa como el desvío o el error porcentual relativo entre el valor medio y el valor conocido. Estableciéndose este parámetro estadístico se obtuvo un error relativo porcentual de 1.680 %, el cual es aceptable hasta 2%, con lo cual se evidencia que ni los excipientes de la formulación, ni los posibles productos de degradación interfieren en la determinación del principio activo, ya que no se detecta ninguna respuesta significativa, con estos resultados se demuestra la selectividad del método. 8, 18, 19
En la evaluación de la linealidad, se demostró que el método produce resultados que son proporcionales a la concentración de trabajo del analito para el rango establecido del 40% al 160% (ANEXO Gráfica Nº 1). Al realizar el análisis estadísticos de los datos recopilados (ANEXO Tabla Nº 1), se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,999954 el cual es mayor al valor mínimo aceptable de 0,999; lo que indica una significativa correlación lineal entre la concentración y el área de lectura que reporta el analito en el análisis. Pero como la información obtenida mediante el cálculo del coeficiente de correlación es limitado y no justifica por sí sola la linealidad, hallamos
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el coeficiente de determinación (r2), que aporta una mayor significancia estadística ya
que expresa la proporción de la variación total del método, es así que obtuvimos un r2
= 0.999908, lo cual indica una probabilidad del 99.9% de que el porcentaje de variación de respuesta es producida por la concentración. 6, 8, 19
Así mismo se determinó el coeficiente de variación de los factores de respuesta que fue de 5.7701%, el cual debe ser menor al 5%; siendo esto un indicativo de una posible falta de linealidad. Pero para confirmar que dicha regresión es lineal se aplicó un test de regresión (test de Student) para evaluar que existe una pendiente significativamente distinta de cero con una probabilidad de 95% y n–2 grados de
libertad, obteniéndose un tregresión de
(
454.630595)cumpliéndose que es mayor al ttabla(
2.093024). 8, 10, 19Además hallamos un t experimental del término independiente realizando el test de verificación del intercepto, aplicando una prueba t-student para evaluar las condiciones de proporcionalidad con una probabilidad de 95% y n–2 grados de
libertad obteniéndose un t exp = 43.309404 que es mayor al t tabla = 2.093024, lo
indicaría que la recta no pasa por el origen de las coordenadas, comprobando de esta manera que el término independiente (valor de a) es estadísticamente diferentes de cero. 10, 19
El parámetro de precisión, se evaluó en términos de repetibilidad y reproducibilidad, determinándose para cada uno de ellos el coeficiente de variación y posteriormente para repetibilidad los límites de confianza individual y promedio.
Para la repetibilidad (ANEXO Tabla Nº 2), con un número de tres determinaciones y en concentraciones de 90% y 110%, se obtuvo un coeficiente de variación al 90% de 0.814% y al 110% de 0.092%, siendo ambos menores al valor máximo aceptable de 2%, lo que se traduce en resultados estadísticamente similares bajo las mismas condiciones de operación en intervalos cortos de tiempo, y a la vez expresa un elevado grado de concordancia entre los resultados de una serie repetida ensayos sobre la misma muestra, demostrándose de esta forma que el método es repetible. 8, 19
Uno de los factores que influyen, con mayor frecuencia, en la repetibilidad es la concentración del analito; debido a que al disminuir la concentración del analito la desviación estándar de las respuestas aumenta. 8, 17
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Además, la repetibilidad depende también del proceso de preparación de las muestra, es decir a mayor manipulación de la muestra mayor probabilidad de que la variabilidad aumente. 8
Por otra parte para la reproducibilidad del método (ANEXO Tabla Nº 3), se encontró resultados similares en tres analistas diferentes y en diferentes días. Obteniéndose los siguientes resultados: un coeficiente de variación al 90% para diferentes analistas y días de 0.6586% y al 110% de 1.0938%, siendo ambos menores al valor máximo aceptable de 3%, lo que demuestra una buena reproducibilidad. 8, 19
Las condiciones operativas y ambientales que pueden influir en el ensayo de reproducibilidad abarcan desde humedad y temperatura ambiental, hasta variación de condiciones instrumentales y reactivos de diferente calidad. 8
Al hallar los límites de confianza promedio se determinó, con una probabilidad del 95% que la concentración del principio activo al 90% se halla entre el 86.041% a 89.592% y para el 110% se halla entre el 109.332% a 109.835%; y que los resultados para los limites de confianza individual con la probabilidad del 95% que la concentración al 90% se halla entre el 84.741% a 90.892% y para el 110% se halla entre el 109.148% a 110.019% de la concentración verdadera. 6, 8
De este modo, podemos constatar que el método es repetible y reproducible; es decir, es suficientemente preciso, por lo que no repercutieron apreciablemente los errores aleatorios en la determinación. 8, 10
La variabilidad del método puede deberse a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados como al analista, el equipo, los reactivos, el tiempo, etc., es por ello la importancia de este ensayo. 8, 10
En cuanto a la exactitud, cuya finalidad es comprobar que el método tiene la capacidad de revelar dentro de un límite aceptable la cantidad de sustancia de interés, que esté presente en la muestra comose puede observar en el ANEXO Tabla Nº 4, el valor del porcentaje de recuperación media fue de 99.86%, el cuál esta dentro de los límites de las especificaciones (98% - 102%) del valor teórico. Señalando así la recuperación como satisfactoria. Se debe tener en cuenta que la recuperación esperada depende de la matriz de la muestra, del procedimiento de la preparación de la muestra y de la concentración del analito en la misma. 10
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Para demostrar que no hay diferencia significativa entre la recuperación media y el 100% se aplico un test estadístico (test de Student) donde se cumple que t exp < t tabla
(0.586585 < 2.570582) para una probabilidad de 95% y n – 1 grados de libertad, corroborándose de esta forma que el método es exacto. Es decir el método proporciona resultados próximos entre el valor teórico y el experimental encontrado. Así mismo para evaluar si el factor concentración influye en los resultados, se utilizó el test de G Cochran, encontrándose un valor G exp de 0.866310, menor al G tabla: 0.870900, para
una probabilidad del 95%, de tres grupos de concentraciones y dos repeticiones, lo que significa que las varianzas de las tres concentraciones utilizadas son equivalentes; o dicho de otra manera que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados. 8, 10, 19
La recuperación esperada dependió de la matriz de la muestra, del procedimiento de preparación de la muestra (más o menos complejas), y de la concentración del analito en la muestra. Aunque es deseable alcanzar valores de recuperación cercanos al 100% existen tipos de muestras de matrices complejas (productos naturales, fluidos biológicos, alimentos, etc.), donde solo se obtienen valores del 50%, 80% ó 90%. Cuando se obtienen porcentajes de recuperación mayores (por exceso) a especificaciones es porque existen interferencias y la selectividad del método no es la adecuada, entonces se obtienen resultados superiores al valor verdadero. En este caso se debería modificar condiciones del método para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro que sea selectivo. En el otro caso, cuando el porcentaje de recuperación obtenido es menor (por defecto), se suele dar cuando la matriz es compleja y la extracción del analito requiere varios pasos, obteniéndose recuperaciones más bajas. Cuando esto se da es conveniente intentar optimizar la preparación de la muestra para mejorar el factor de recuperación. 8, 10, 19
Con respecto al rango como cumple con la evaluación de la linealidad, precisión y exactitud, el método funciona correctamente entre 40% - 160% que fueron las concentraciones máxima y mínima trabajadas. Por todo lo antes mencionado se comprobó, la validez del método analítico dentro del rango estudiado. 10
También se determinó el rango analítico, indicándonos que analíticamente el método funciona correctamente desde la concentración de 0,0068 mg/mL (límite de cuantificación), hasta el límite de linealidad más de 0.1760 mg/mL. 13