Cambios en el contenido de los nucleótidos

Dentro de los cambios bioquímicos postmortem que ocurren en los músculos de los organismos marinos, la desfosforilación y la desaminación de ATP ha sido ampliamente estudiada con el propósito de monitorear la frescura y la vida útil de estos productos. Paralelamente con estas investigaciones, se han desarrollado y perfeccionado distintos métodos para determinar y cuantificar el ATP y sus productos de degradación. Estos incluyen procedimientos enzimáticos (Jahns y col.,1976; Ehira y col., 1986; Karube y col., 1984), ensayos ópticos (Khan y Frey, 1971) y cromatográficos (Ryder, 1985; Iwamoto y col., 1987). Actualmente, la técnica más utilizada es la cromatografía líquida de alta performance o HPLC (Iwamoto y col., 1987; El-Okki y col., 1988; Ryder, 1985; Matsumoto y Yamanaka, 1990; Price y col., 1991; Cappeln y col., 1999). Dicha técnica ha sido utilizada tanto con columnas de intercambio iónico como con columnas de fase reversa (Hu y col., 1991). En la presente tesis, la separación cromatográfica fue realizada utilizando una columna de fase reversa según el método descripto por Ryder (1985). Como se muestra en la Figura 3.1.1, los estándares de ATP y de sus catabolitos fueron efectivamente separados mediante un gradiente de elusión (metanol:agua) en 30 min. La curva de calibración obtenida fue lineal en el rango de trabajo, de 0 a 1,00 nmoles (Tabla 3.1.1), comprobándose además una gran precisión de los resultados, con coeficientes de variación menores al 5%.

Los nucleótidos presentes en las muestras fueron identificados comparando los tiempos de retención y las características de los picos, con estándares comerciales. En la Figura 3.1.2 A se puede observar un perfil cromatográfico obtenido del extracto perclórico del músculo de lenguado al inicio del estudio (tiempo 0), donde IMP constituyó el nucleótidos predominante, detectándose además pequeñas cantidades de AMP e Hx. En cambio, en el cromatograma perteneciente ejemplares almacenados por 9 días en hielo (Figura 3.1.2 B) se puede observar que los nucleótidos predominantes son HxR e Hx.

Figura 3.1.1 Cromatograma correspondiente a los patrones de ATP

(adenosin trifosfato), ADP (adenosin difosfato), AMP (adenosin monofosfato), IMP (inosina monofosfato), HxR (inosina), Hx (hipoxantina), Xt (xantina), Ade (adenosina) y Ad (adenina).

Tabla 3.1.1. Resultados del análisis de regresión de las curvas

de calibración de patrones de nucleótidos.

Patrones Coeficiente de_Regresión a b

ATP 0,98 10,69 0,85 ADP 0,96 4,51 0,10 AMP 0,97 20,92 3,01 IMP 0,97 23,35 3,70 HxR 0,97 37,41 3,37 Hx 0,98 22,58 4,10 Xt 0,97 8,87 2,34 Ade 0,97 22,62 4,40 Ad 0,99 26,67 0,14

(Ajuste lineal: Concentración (nmoles) = a x respuesta (mm) + b)

Figura 3.1.2. Cromatogramas de los nucleótidos presentes en

músculo de lenguado. A: tiempo 0; B: a 9 días de almacenamiento en hielo

En la Figura 3.1.3 se muestran los cambios que ocurren en las concentraciones de los nucleótidos de adenina y en sus compuestos de degradación durante el almacenamiento del lenguado patagónico en hielo. A tiempo 0 de almacenamineto el contenido total de los mismos fue de 12,3 µmoles/g de músculo (peso húmedo). Valores similares fueron encontrados en pez sierra, Scomberomorus sierra (Pacheco Aguilar y col., 2002). La concentración inicial de ATP y de sus compuestos de degradación depende de distintos factores tales como: la especie, el tipo de músculo, el estado nutricional del pez, y al método de captura (Huss, 1995). Valores iniciales de 9,3 µmoles/g fueron descriptos en seriola (Seriola quinqueradiata) (Murata y Sakaguchi 1986) y en bonito negro (Mazorra-Manzano y col. 2000), mientras que en calamar gigante (Dosidicus gigas) los valores fueron menores (Pacheco Aguilar y col., 2002).

En el presente estudio no se detecto la presencia de ATP ni de ADP. El AMP presentó una concentración inicial de 2,3 ± 0,4 µmoles/g. Después de 2 días este valor descendió significativamente (P < 0,05) a valores cercanos a cero, indicando que la hidrólisis de ATP a IMP en el lenguado ocurriría durante los dos primeros días de almacenamiento en hielo. Esto podría deberse, al menos en parte, al método de captura utilizado (redes de arrastre de fondo) y al tiempo necesario para que los ejemplares de lenguados en hielo arriben al laboratorio. Se ha informado que la conversión de ATP a IMP se debe, en gran parte de las especies marinas estudiadas, se completa dentro del primer día post-captura y se atribuye exclusivamente a la acción de enzimas autolíticas (Jones 1965; Hiltz y col., 1971; Ólafsdóttir y col., 1997)

A tiempo cero, el IMP fue el nucleótido predominante con una concentración 10,5 ± 0,2 µmoles/g. La misma descendió alrededor de un 60% durante los dos primeros días de almacenamiento en hielo y luego disminuyó gradualmente hasta un valor de 1,7 ± 0,5 µmoles/g a los 12 días de almacenamiento. Resultados similares fueron descriptos para otras especies. Ryder (1984), informó en jurel Trachurus

novaezelandiae un descenso en los valores de IMP de 10,3 µmoles/g a 1,10 µmoles/g

luego de 23 días de almacenamiento en hielo, mientras que en atún (Thunus alalunga) almacenado en hielo fue informado un descenso progresivo de 10,6 µmoles/g a 4,5 µmoles/g luego de 15 días (Price y col., 1991). Diversos autores han sugerido que el

0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 C o ncent ra ci ó n ( µ mol es /g )

Tiempo de almacenamiento (días)

AMP IMP HxR Hx

Figura 3.1.3. Cambios en el contenido de adenosína monofosfato

(AMP), inosina monofosfato (IMP), inosina (HxR) e hipoxantina (Hx) en músculo de lenguado almacenado en hielo. Cada punto

contenido de IMP es un buen indicador de frescura, ya que es el principal responsable del deseable aroma y sabor a pescado fresco (Woyewoda y col., 1986, Huss, 1995).

Un bajo contenido de HxR (0,1 µmol/g) fue observado durante todo el periodo de almacenamiento. Contrariamente los niveles de Hx se incrementaron progresivamente hasta el quinto día de almacenamiento. Entre el quinto y el séptimo día se observó un incremento significativo (P < 0,05), alcanzando un valor máximo de 4,4 ± 0,9 µmoles/g. Posteriormente los niveles de Hx permanecieron sin mayores cambios. Como se puede observar en la Figura 3.1.3, hay una falta de correspondencia entre la disminución de los niveles de IMP y los niveles de HxR, que podría relacionarse con una mayor velocidad de conversión de HxR a Hx que de IMP a HxR (Greene y col., 1990). Esto resulta sumamente importante en términos de calidad, ya que la IMP es una sustancia resaltadora del sabor, mientras que la Hx imparte un sabor amargo, típico del pescado deteriorado (Hughes y Jones, 1966). La formación de Hx en tejido muscular del pescado post-mortem refleja la fase inicial del deterioro autolítico y de las alteraciones microbiológicas (Woyewoda y col. 1986). Algunos especies pesqueras como el salmón (Kim 1986); medregal del Japon, Seriola quinqueradiata (Murata y Sakaguchi 1986); pargo colorado, Lutjanus sebaes (Williams y col., 1991) y varias especies tropicales (Bremner y col., 1988; Williams y col., 1991) acumulan HxR. Mientras que otras especies tales como el carpas (Uchiyama y Ehira 1974), lenguados (Kassemsarn y col., 1963), abadejo Atlántico (Dingle y Hines 1971), pez sierra (Williams y col., 1991) y otros acumulan Hx. En función a la variabilidad de metabolización de HxR a Hx. que presentan las distintas especies pesqueras Ehira y Uchiyama (1986) clasificaron algunas especies pesqueras en los siguientes grupos:

- Especies formadoras de inosina (HxR), las que presentan una relación de

HxR/Hx > 5/1: la mayoría de los escombridos, jurel, atún, pez espada, salmon y

varias especies tropicales.

- Especies formadoras de hipoxantina (Hx), las que presentan una relación de

HxR/Hx < 1/5: bonito, peces planos, calamar y otros.

- Especies de tipo intermedias, las que presentan una relación de HxR/Hx entre 5/1

y 1/5: salmón, congrio, corvina común, congrio, calamar y otros

Ehira y Uchiyama, (1986) determinaron que la concentración de Hx presenta una alta correlación con la perdida de frescura en especies formadoras de Hx, una moderada relación en especies de tipo intermedia y una muy baja correlación en especies formadoras de HxR. De acuerdo a lo descripto previamente, los resultados obtenidos en este estudio indicarían que P. patagonicus es una especie formadora de Hx. Un alto coeficiente de correlación (r = 0,96) fue obtenido entre la concentración de Hx y el tiempo de almacenamiento, lo cual indicaría que la Hx podría ser un buen indicador de frescura para esta especie. Resultados similares informados en otras especies pesqueras (Jacober y Rand, 1982, Burns y Kee, 1985; Zhang y Lee, 1997).