Caracterización de la anatomía anorrectal de la rata y definición del

3.2.3.1. Anestesia.

Se llevó a cabo mediante dos protocolos:

1. Anestesia inhalatoria: empleada en el estudio de seguimiento acorto plazo sin estudio funcional:

a. Inducción con oxígeno a 3 lpm e Isoflorane a 5lpm.

b. Mantenimiento con oxígeno a 1,5-2 lpm y Forane (Isoflorane) a 1,5-2 (según la profundidad anestésica del animal).

c. Educción parando el Isoflorane y manteniendo oxígeno 3-4 minutos, en decúbito prono para evitar aspiraciones.

2. Anestesia intraperitoneal: empleada en el estudio de seguimiento a largo plazo y estudio funcional. Las dosis empleadas finalmente serán

explicadas con más detalle en resultados (ketamina 50mg/kg y xilacina 5mg/kg si hay cirugía y registro y 30mg/kg y 3mg/kg respectivamente si sólo se hace estudio funcional).

3.2.3.2. Caracterización de la anatomía anorrectal:

Cuando comenzó este proyecto de investigación nuestro conocimiento de la anatomía esfinteriana murina era limitado y no disponíamos de buenos tratados de anatomía animal. Por un lado revisamos bibliografía al respecto, que nos confirmó la similitud con la anatomía humana, y por otro dedicamos algunos animales, a los que también se les realizaron pruebas de estudios funcionales, para obtener una caracterización anatómica (macro y microscópica) de la región suficiente que nos permitiera describir un modelo de lesión del aparato esfinteriano reconocible y estable. Llevamos a cabo varias disecciones perianales y la realización de estudios de piezas de amputación en cortes sagitales, transversales y coronales así como preparaciones histológicas en Hematoxilina/Eosina y tricrómico de Mason.

3.2.3.3. Metodología de daño quirúrgico.

Al inicio de este protocolo había muy poca bibliografía acerca de modelos de incontinencia fecal en ratas. Inicialmente se consideró que en la realidad clínica la mayoría de las incontinencias son de origen plurifactorial (daño esfinteriano, daño neural por elongación, etc.) y por ello se trabajó en un modelo de daño por parto simulado. Consistía en la introducción de un globo (sonda vesical tipo Foley) en la vagina durante períodos prolongados de tiempo. Observamos una gran variabilidad en las lesiones y una dificultad en estandarizar dicho mecanismo lesional lo que podría dificultar analizar los hallazgos.

Por ello se decidió cambiarlo por otro más estandarizable: la sección completa del aparato esfinteriano (no siempre presente en la clínica real pero que consideramos como peor escenario posible para la continencia). Comenzamos por un mecanismo muy agresivo que consistía en realizar una sección completa desde la luz del canal anorrectal hasta la vagina incluyendo ambas paredes y el septo rectovaginal.

Abandonamos esta metodología porque generaba bastantes problemas de infecciones regionales.

Finalmente optamos por un método más selectivo; una sección longitudinal desde el margen anal en la pared anterior (rafe anterior) sin cortar la mucosa, únicamente de las capas musculares, siguiendo estos pasos:

0. Se colocar al animal anestesiado en decúbito supino sobre un paño con una manta de calor eléctrica comercial debajo para prevenir su hipotermia. Se sujetan las cuatro patas estiradas con tiras de esparadrapo. Se tensa en sentido opuesto la piel abdominal con tiras de esparadrapo grueso.

1. Asepsia y antisepsia en zona operatoria: rasurado con maquinilla eléctrica y uso de Clorhexidina/Betadine tópico con gasa estéril. Delimitar campo de trabajo con 4 gasas estériles o con fragmentos de campo estéril plástico según disponibilidad (ver imágenes 13 y 14).

2. Identificar ano, vagina y tabique anorrectal.

Imágenes 13 y 14: Delimitación del campo de trabajo estéril.

3. Inyección subcutánea de solución de epinefrina (éste paso se obviaba si se iba a realizar estudio funcional para evitar el efecto que pudiera tener sobre el esfínter), como se aplica en clínica, para disminuir el sangrado. Se aplican 0,5ml en cada cuadrante y se difunde mediante masaje con gasa.

4. Tutorización del conducto rectoanal con un Abbocath^® de 14G o con un bastoncillo de cultivo microbiológico.

5. Marcaje del margen anal en su cara anterior con un punto de seda de 6/0 para realizar tracción hacia la cola del animal. Además evita la salida del tutor del conducto y estira el conducto rectoanal.

6. Con dos pinzas hacer tienda de campaña con la piel del tabique para aislarla del conducto anal. Sección de piel perianal circunferencial o arciforme en pared anterior con tijeras a unos 3mm del margen anal. La incisión tiene de 10 a 15 mm de longitud (se empezaba con 10mm y según necesidades de la disección posterior se podía ampliar a 15mm). Si no se dispone de ayudante se daban 2 puntos de seda 6/0 en los extremos que se anclan a las gasas del campo quirúrgico para mantener abierta en todo momento la incisión. Ver imágenes 15 y 16.

Imágenes 15 y 16: Incisión quirúrgica (arciforme anterior).

7. Disección en sentido vertical para separar la grasa hasta llegar al conducto.

Ayudarse con bastoncillo estéril para rechazarla hacia los laterales con el objetivo de visualizar una longitud de unos 20 mm del conducto. 5. Se prosigue hacia el margen anal hasta conseguir la identificación visual del EAE (es una línea de color más denso que el interno) en gran parte de los casos (ocasionalmente no se apreciaba por ser

muy fino; en estos casos sirve de límite el punto de tracción del punto 5 o se empleaba la lupa quirúrgica). Ver imágenes 17-18.

Imágenes 17 y 18: Identificación del EAE como una línea de color rojo más vivo.

8. Una vez identificado el conducto muscular, se toma la capa muscular (músculo liso) con dos pinzas de micro disección, se alza y se realiza una incisión progresiva hasta observar la herniación de la submucosa

9. Se prolonga la disección del plano submucoso en sentido longitudinal y se realiza una sección longitudinal (de grosor completo) de la muscular. En sentido caudal se avanza hasta el margen anal (identificado por el punto de marcaje) y en sentido craneal hasta completar unos 10mm de sección. Con ello seccionamos EAI y EAE.

10. En caso de que haya perforación incidental de la mucosa se realiza sutura primaria con puntos de 6/0 de Vycril en puntos simples. Ver imágenes 19-22.

Imágenes 19-22: Lesión quirúrgica del aparato esfinteriano tal y como se describe en los pasos 8 a 10 del texto.

11. Tratamiento según grupos de experimentación. Reparación de la sección si procede con 3-4 puntos simples (biosuturas o suturas convencionales) con/sin inyección celular.

11. Aproximación de la grasa separada previamente con un punto de Vycril® 6/0.

12. Sutura de la incisión cutánea con puntos sueltos con nudo interno e invaginantes de Vicryl® 6/0.

Imagen 23: Cierre de la herida quirúrgica con puntos con nudo invertido.

13. Nuevo lavado del campo con povidona yodada y aplicación de apósito plástico en aerosol (Nobecutan®).

13. Inyección subcutánea en nuca (cervical posterior) de analgésico de segundo escalón según peso del animal: 10 mg/kg de petidina. Se repite a las 24 horas.

3.2.4. TÉCNICAS DE REPARACIÓN ESFINTERIANA Y APORTE DE ASCS; GRUPOS