Las muestras se pesaron en una balanza analítica Voyager Ohaus modelo Explorer E01140. Se solubilizaron con la ayuda de un ultrasonicador Elma S 40 Elmasonic y se incubaron en un baño termostatizado HAAKE DC10 con una precisión de ± 0,1ºC.
El pH de las muestras se determinó utilizando un pH-metro Hanna instrument HI 255 combined meter.
Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis. Se emplearon celdas de cuarzo de 1cm de paso óptico Hëllma Analytics.
Los estudios de ITC se realizaron utilizando un titulador VP-ITC Microcalorímetro (MicroCal, Inc., Northampton, MA)
Los espectros de NMR fueron obtenidos usando un espectrómetro Brucker Avance II 400 de alta resolución, equipado con resolución digital, sonda de detección inversa y unidad de temperatura variable. El equipo operó a 400,16 MHz para 1H y a 100,63 para 13C. Se utilizaron tubos de 5 mm de diámetro
Merck®. Todos los experimentos se desarrollaron en solución tamponadas en D2O.
2.1.2 Métodos
2.1.2.1 Diagrama de Solubilidad de Fases
Los diagramas de solubilidad (DSF) se obtuvieron de acuerdo al método descrito por Higuchi y Connors (Higuchi, 1965). Un exceso de HCT se mezcló con soluciones tamponadas de diferentes valores de pH (3; 5,5; 6,8; 7,4; 8 y 10), conteniendo cantidades crecientes de βCD (0 – 12 mM). Los tubos se colocaron en un baño termostatizado a diferentes temperaturas (25, 37 y 45 °C) durante 72 h, para alcanzar las condiciones del equilibrio. Dos veces al día, los tubos fueron sometidos a mezclado por vortex, para favorecer aún más la solubilidad de la
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HCT. Una vez alcanzado el equilibrio de fases, las muestras fueron filtradas a través de filtros de membranas de tamaño de poro de 0,45 µm. Se midió el pH de las soluciones obtenidas y, luego de hacer las diluciones correspondientes, se cuantificó la cantidad de HCT solubilizada, con un espectrofotómetro UV-Vis a 270 nm; la βCD no tiene absorbancia a la longitud de onda (λ) seleccionada.
Los DSF fases se construyeron graficando la concentración de soluto medido en función de la concentración del ligando en cada solución; en donde S0
representa la solubilidad en equilibrio del soluto en ausencia del ligando. Las constantes de estabilidad aparente (
K
, M-1) se obtuvieron aplicando la ecuación2.1.
= /( ( − ))
Ecuación 2.1
Cada experimento se realizó por triplicado, informándose cada valor, con el error correspondiente (± DS).
2.1.2.2 Titulación Isotérmica Calorimétrica
Los experimentos de titulación isotérmica calorimétrica (ITC) se realizaron a 20, 25, 37 y 45 °C, utilizando un microcalorímetro. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando la concentración de máxima solubilidad, tanto para la HCT como para la βCD, por lo cual la concentración inicial del huésped (HCT) fue de 2 mM, dentro de la celda de titulación; mientras que la solución inicial del receptor (βCD), en la jeringa de infusión, fue de 12 mM. Esta estrategia de colocar el huésped en la celda de titulación y titular con el ligando, se utiliza cuando el fármaco en estudio tiene baja solubilidad (Illapakurthy y col., 2005).
Para cada experimento, se agregaron 28 alícuotas de 10 µL cada una de solución de βCD, para titular la solución de HCT dentro de la celda de reacción (1,4542 mL). Ambas soluciones se encontraban al mismo valor de pH (3; 5,5; 6,8; 7,4; 8 y 10). Las alícuotas fueron agregadas a intervalos de 3,3 minutos, tiempo suficiente para permitir que se equilibren las soluciones dentro de la celda. Antes de cada ensayo de formación de complejo realizado, se midió el calor liberado durante la reacción de dilución de la βCD, titulando con 28 inyecciones (10 µL cada una) en la solución tamponada correspondiente al del
Capítulo 2: Complejos de Inclusión
33
ensayo, utilizándose este valor como blanco a la hora de calcular las constantes de estabilidad.
Durante el experimento y como consecuencia de la dilución de la muestra en la celda de titulación, la concentración del huésped varió de 2 a 1,67 mM, mientras que la concentración del receptor estuvo en un rango de 0 a 2 mM. Todas las soluciones fueron desgasificadas antes de comenzar las titulaciones. Los datos obtenidos de los experimentos fueron procesados luego de ser convertidos en isotermas de unión. Antes de ajustar al modelo apropiado, se descontó la isoterma de calor de dilución de la βCD a la isoterma correspondiente al calor de unión. La primera inyección (5 µL) se descartó para evitar cualquier efecto de difusión entre los materiales de la jeringa y la celda calorimétrica.
Cada experimento fue realizado por triplicado para asegurar la reproducibilidad, los datos obtenidos de las réplicas exhibieron diferencias menores al 10%. Las entalpías de unión (
ΔH
, kJ·mol−1), estequiometría (n
) yconstantes de estabilidad (
K, M
-1) fueron obtenidas por un modelo de ajuste nolineal, utilizando el software propio del equipo MicroCal Origin.
Los ensayos de ITC se llevaron a cabo en colaboración con la Dra. Mariana A. Fernández, investigadora del INFIQC-CONICET, en el departamento de Química Orgánica, de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC.
2.1.2.3 Resonancia Magnética Nuclear
Los espectros de NMR de protones (1H NMR) fueron realizados a 25 y 45°C
en soluciones tamponadas (0,2 M)/D2O (80/20 %v/v), ajustando el valor de pH a
3; 5,5; 6,8; 7,4; 8; 8,7; 9,5; 10 y 12, con NaOH o D2O. El corrimiento químico (δ)
del solvente residual a 4,8 ppm se utilizó como referencia interna. Debido a su baja solubilidad en agua, las soluciones de HCT o HCT más βCD se prepararon de la siguiente manera: se colocó un exceso de HCT en 5 mL de una solución acuosa de βCD (12 mM) en una solución tamponada de fosfatos (0,2 M)/D2O o
D2O, los cuales se agitaron por 24 h a 25 °C. La suspensión resultante se filtró
antes de realizar los espectros de 1H NMR. La variación de desplazamiento
químico (Δδ) de protones para la βCD y la HCT, originados por el fenómeno de acomplejamiento, se calculó aplicando la ecuación 2.2.
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∆ = −
Ecuación 2.2
donde, δac es el corrimiento de los protones de la βCD ó la HCT cuando
están acomplejadas y δlibre, es el corrimiento de los protones de la βCD ó la
HCT cuando están solas.
2.1.2.4 Análisis Estadístico de los Datos
El análisis estadístico de los datos se realizó utilizado el test-
t
de Student. En este test, se rechaza la hipótesis nula (H0) cuando p ≤ 0 al nivel designificación elegido. Es decir si se trabaja con un 95% de confianza, p= 0,05. H0
plantea que no hay diferencia entre las muestras comparadas. Por lo tanto, se considera que una diferencia es estadísticamente significativa cuando se cumple que p es ≤ 0,05; siendo p la probabilidad.
2.1.3 Resultados y Discusión
2.1.3.1 Diagramas de Solubilidad de Fases
Los DSF son herramientas muy útiles para el estudio de complejos de inclusión entre componentes poco solubles en agua y las CDs. Si bien no verifican la formación del complejo de inclusión, nos permiten describir como aumenta la solubilidad del IFA a medida que aumenta la concentración del receptor (CD).
Higuchi y Connors, proponen una clasificación de los complejos basándose en sus diagramas de solubilidad de fases; por ejemplo, cómo cambia la solubilidad aparente de una molécula de soluto (IFA) cuando aumenta la concentración del ligando disuelto (CD), debido a que aumenta la solubilidad acuosa del IFA por el complejo formado (Higuchi, 1965).
Como se mencionó anteriormente, los DSF se construyen graficando la concentración del soluto en función de la concentración del ligando en solución;
Capítulo 2: Complejos de Inclusión
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de los cuales se obtienen diagramas de dos clases, de tipo A y de tipo B, con algunas variaciones dentro de cada una de ellas.
En soluciones acuosas, los perfiles de solubilidad de fase tipo A se obtienen cuando la solubilidad del soluto aumenta con el incremento en la concentración del ligando, a través de la formación de complejos solubles en agua. Cuando el complejo es de primer orden con respecto al soluto y de primer orden con respecto al ligando, entonces estamos en presencia de perfiles del tipo AL. Si el
complejo es de primer orden con respecto al soluto pero de segundo orden o mayor con respecto al ligando, tenemos perfiles del tipo AP. Los perfiles del tipo
AN son muy difíciles de interpretar, probablemente respondan a cambios en la
constante dieléctrica inducidos por el ligando en el medio acuoso de acomplejamiento, a cambios en la solubilidad del complejo o la agregación de las moléculas de ligando. Los DSF tipo B indican la formación de complejo con limitada solubilidad en el medio acuoso de acomplejamiento. Los complejos más comúnmente formados, entre los IFA y las CD, son del tipo 1:1 (Messner y col.,
2010). En la figura 2.3 se muestra un esquema con de los distintos tipos de DSF.