Cassettes génicos: estructura y función

Los cassettes génicos presentan tamaños y funciones variables y, sin embargo, tienen una estructura común. Consisten básicamente, en una secuencia codificante que en el extremo 3’ presenta un lugar de recombinación denominado attC.

Los elementos attC son repeticiones invertidas imperfectas. El primer attC descrito presentaba 59pb de longitud, por ello el término “elemento 59-bp” o 59-be, se utiliza comúnmente, aunque los attC no son secuencias altamente conservadas y varían de 57 a 141 pb de longitud [93_].

Dos secuencias de siete pares de bases denominadas core y core inverso se encuentran en los extremos de cada attC. El core se localiza en el extremo 3’ del attC, y presenta una secuencia consenso GTTRRRY (que con mayor frecuencia es GTTAGGC); mientras que el core inverso esta localizado en el extremo 5’ y su secuencia consenso es RYYYAAC (frecuentemente GCCTAAC). Además a la izquierda del cassette insertado, también se encuentra la secuencia consenso GTTRRRY, del attI, de manera que el cassette queda flanqueado por dos secuencias iguales (figura 1.13).

Figura 1.13 Estructura de un cassette génico. El attC esta formado por el core y por el core inverso, separados por una región variable. Los extremos del cassette están definidos por dos cores, el del attI, a la izquierda del cassette y, el del attC, a su derecha. La recombinación tiene lugar entre la G del primer core y la T del segundo (en el esquema se ha marcado con un guión). R, purina; Y, pirimidina.

La integración y la escisión de los cassettes está mediada por la integrasa. La integración se produce por un mecanismo de recombinación lugar-especifica, en el que la integrasa reconoce el attI del integrón y el attC del cassette y realiza la recombinación entre la G del attI y la T del core. La recombinación puede tener lugar entre attI y attC, o bien entre dos attC, si ya existen cassettes integrados en la estructura, y además puede implicar a un lugar no específico denominado lugar secundario (que generalmente presenta la secuencia GWTMW (W: T/A; M: A/C)). Esta recombinación mediante un lugar segundario ocurre con muy baja frecuencia, pero permitiría la integración de cassettes fuera del integrón aunque esta integración no seria reversible, es decir, al no reconstruirse de nuevo las secuencias attC, la escisión de los cassettes no volvería a ser posible.

Los cassettes no suelen incluir promotores, por lo que normalmente se expresan por acción de un promotor común localizado en la región 5’-CS de integrón, el P1. Dentro de un mismo integrón pueden coexistir varios cassettes (denominados cassette array), y aunque suelen insertarse en la misma dirección, lo que permite su expresión, ésta no es uniforme: los cassettes distales presentan una expresión reducida por la presencia de los cassettes más proximales, ya que las repeticiones invertidas de los attC previos formarían loops que

Region variable 54-135 nt

G-TTRRRY Cassette génico _{RYYYAAC G-TTRRRY} Core inverso Core

attC attI

podrían silenciar completamente la expresión de los cassettes más distales, funcionando también así como terminadores de la transcripción. Esto afectaría al nivel de resistencia alcanzado por el microorganismo a los antibióticos, cuyos genes de resitencia estan codificados por el cassette array; el mayor nivel seria adquirido cuando el cassette se encuentra inmediatamente después del extremo 5’-CS, y por tanto más cerca del promotor PANT [

94_].

La estabilidad en el orden de los cassettes, también es objeto de debate, ya que los análisis de los tipos de integrones predominantes en múltiples hospitales europeos parecen mostrar que son estructuras estables, pues se han encontrado combinaciones conservadas de cassettes génicos tanto entre aislados procedentes de orígenes diversos, como de bacterias sometidas a presión antibiótica durante largos periodos de tiempo [95_{]; en cambio, los}

estudios in vitro demuestran que pueden existir cambios de orden de los cassettes dentro del integrón, aunque aparentemente, esta reorganización se daría únicamente en condiciones ambientales específicas. Además de reorganizaciones, también pueden darse deleciones y duplicaciones de los cassettes [96_{]. La escisión de los cassettes génicos está también mediada}

por la integrasa; una vez “libre”, cada cassette forma un intermediario circular la integración del cual en el attI del mismo integrón (lugar de recombinación por el que la integrasa tiene mayor afinidad) o en lugares secundarios, llevaría a nuevas reorganizaciones de los cassettes génicos dentro de los integrones.

El intercambio de cassettes entre diferentes integrones, a penas ha sido estudiado; un único estudio realizado in vitro con Salmonella enterica como donador y varios plásmidos como aceptores demuestra que sí es posible, dependiendo del tipo de plasmido utilizado [97_].

Aparentemente los cassettes génicos se integran al azar aunque las combinaciones más útiles para los microorganismos que las llevan son las que se seleccionan con más frecuencia por las condiciones ambientales [98_].

Suelen codificar genes de resistencia para múltiples antibióticos, incluso de aquellos que, clínicamente, hace mucho que dejaron de usarse como la estreptomicina y la espectinomicina; también pueden codificar genes de resistencia a diversos antisépticos. Se han identificado más de sesenta cassettes génicos diferentes implicados en la resistencia a los antimicrobianos.

Los grupos más importantes de antibióticos a los que confieren resistencia son los β-lactámicos y los aminoglicósidos, aunque también codifican con elevada frecuencia genes relacionados con la resistencia a trimetoprim y cloranfenicol. También se han aislado pautas de lectura abiertas de las que se desconoce la función, pero asociadas a attC en forma de cassettes génicos [99_].

Un integrón puede presentar desde cero cassettes integrados (integrón “vacío”) hasta cinco o seis de ellos. Las combinaciones de genes son múltiples, e incluso pueden existir cassettes repetidos dentro de un mismo integrón.