La principal funcion de la inmunoglobulina A (IgA) es la inmunoprotección de las mucosas. Los homogenizados de colon utilizados en WB, también se usaron para cuantificar los niveles de IgA, empleando el kit comercial Rat IgA ELISA Kit (ref. E111- 102, Bethyl Laboratories®, EEUU). Es un ELISA de tipo sándwich, en donde la placa tiene adherida en el fondo de los pocillos anticuerpos específicos para la detección de IgA de rata, el cual capturará la IgA presente en la muestra. Posteriormente, un anticuerpo secundario biotinilado se unirá a las IgAs capturadas, formando un complejo que en presencia de un conjugado de estreptavidina-peroxidasa catalizarán una reacción colorimétrica sobre el substrato cromogénico. La reacción se cuantifica por espectrofotometría a 450nm (Synergy 2, BioTek, Alemania), y la absorbancia es
proporcional a la cantidad de IgA presente en la muestra. El nivel de detección mínimo del kit es de 1.37 ng/ml.
4.7 CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE LPS.
El lipopolisacárido (LPS) es un componente fundamental de la pared de las bacterias Gram negativas, dicho componente se cuantificó en el plasma como índice de presencia de componentes bacterianos en el organismo. Para ello se utilizó un kit comercial LAL Chromogenic endpoint assay (ref. HIT302, Hycult Biotechnology, EEUU), el cual se basa en la capacidad del LPS de causar una coagulación intravascular en los cangrejos herradura (Limulus polyphemus). Dicho kit utiliza un lisado de amebocitos del Limulus (LAL), el cual en presencia del LPS desencadena una reacción enzimática que conlleva a la opacidad y gelidificación de la mezcla. En presencia de un substrato incoloro, la reacción enzimática genera una coloración amarilla que se mide por a 405nm (Synergy 2, BioTek, Alemania). Siguiendo las especificaciones del protocolo del kit, las cantidades de LPS (en unidades de endotoxina por ml, EU/ml). El nivel de detección mínimo del kit es de 0.04 EU/ml.
4.8 CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CITOQUINAS POR ELISA.
Se usaron los homogenizados totales de PFC para la medición de los niveles de algunas citoquinas mediante ELISA, técnica basada en el reconocimiento mediante la unión específica antígeno-anticuerpo. Los resultados se normalizaron con la concentración proteica presente en cada muestra.
Rat TNFα ELISA Kit (ref. ELR-TNFalpha-001C, RayBiotech®, EEUU); tiene un
límite de detección de 25pg/ml. La curva estándar proporcionada en el kit tiene un rango de 0 a 20000pg/ml.
Rat IL1β ELISA Kit (ref. ELR-IL1beta-001C, RayBiotech®, EEUU); tiene un límite
de detección de 80pg/ml. La curva estándar proporcionada en el kit tiene un rango de 0 a 50000pg/ml.
Rat IL10 ELISA Kit (ref. ELR-IL10-001C, RayBiotech®, EEUU); presenta un límite
de detección de 10pg/ml. La curva estándar proporcionada en el kit tiene un rango de 0 a 6000pg/ml.
4.9 CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LOS FACTORES DE TRANSCIPCIÓN.
La actividad de los factores de transcripción estudiados en esta tesis, NFκB, PPARγ y NRF2 se realizó en los extractos nucleares de PFC mediante la utilización de los kits comerciales NFκB (p65) Transcription Factor assay kit (Ref. 10007889, Cayman Europe, Estonia), PPARγ Transcription Factor Assay Kit (Ref. 10006855, Cayman Europe, Estonia) y NRF2 Transcription Factor Assay Kit (Ref. 600590, Cayman Europe, Estonia). Es un ELISA, en donde se detecta la capacidad de unión de los factores de transcripción presentes en la muestra a las secuencias de consenso de DNA que se encuentran en el fondo de los pocillos de la placa de cada kit (Fig. 24). Dicha actividad se midió a 450nm (Synergy 2, BioTek, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los valores obtenidos se normalizaron con la concentración proteica presente en cada extracto.
Figura 24. Esquema metodológico de los kits de actividad transcripcional de NFκB y PPARγ.
4.10 CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE PROSTAGLANDINAS EN CORTEZA PREFRONTAL.
a) Preparación de la muestra: Uno de los segmentos de PFC fue homogenizado
por sonicación en 400μl de tampón fosfato 0,1M pH7.4, suplementado con EDTA 1mM e indometacina 10μM. Al homogenizado se le añade 1ml de etanol absoluto (Merk, GB), se agitan y se dejan reposar por 15 minutos a 4°C. Luego se centrifugan a 3000g durante 10 minutos a 4°C y se recoge el sobrenadante, el cual se acidifica con 10μl de ácido acético glacial (Sigma, España). Nuevamente se dejan reposar por 15 minutos a 4°C y se centrifuga a 500g durante 2 minutos, se extrae el sobrenadante y se añade a la columna de C18 previamente activada.
La activación de las columnas C18 (C18 Sep-Pak®, Waters Corp., EEUU) se realiza agregando 3ml de metanol, seguidos de 3 ml de agua milli-Q. Una vez activadas y lavadas las columnas se agrega la muestra y se deja filtrar por gravedad, una vez que toda la muestra ha pasado por la columna, se lava la columna con 3ml de agua milli-Q y luego con 3ml de hexano (Sigma, España). Finalmente, el contenido de prostaglandinas unidas a la fase sólida de la columna se eluyeron con 1ml de acetato de etilo (Sigma, España). Las muestras purificadas se almacenaron a -80°C hasta el día siguiente, donde se procedió a evaporar el disolvente bajo un flujo continuo de nitrógeno a temperatura ambiente. El contenido restante se resuspendió con 250μl del tampón comercial proporcionado por el kit.
b) Cuantificación de los niveles de PGE2: Para la medición de los niveles de PGE2
en la corteza prefrontal, se utilizó un kit comercial de inmunoensayo enzimático competitivo “Prostaglandin E2 EIA Kit” (Ref. 514010, Cayman Europe, Estonia). El
fundamento del kit se basa en la competición entre la PGE2 (presente en la muestra) y el conjugado PGE2-acetilcolinesterasa (proporcionado por el kit) por la unión a los anticuerpos anti-PGE2 presentes en el fondo de los pocillos. Como la concentración del conjugado es constante, la variabilidad de la unión está dada por la cantidad de PGE2 presente en la muestra, cuya cantidad será inversamente proporcional a la del conjugado unido a los anticuerpos. Posteriormente la placa se lava y se incuba con el reactivo de Ellmans, el cual contiene el sustrato de la acetilcolinesterasa, generándose un producto de color amarillo que puede medirse por espectrofotometría a 412nm
(Synergy 2, BioTek, Alemania). El límite de detección del ensayo es de 15pg/ml (80% B/B0).
c) Cuantificación de los niveles de 15d-PGJ2: Para medir los niveles de 15d-PGJ2
en PFC, se usó un kit de ELISA comercial (15-deox-Δ12,14-Prostaglandin J2 ELISA, DRG®, Alemania). Al igual que el kit de la PGE2 es un inmunoensayo competitivo, en donde la 15d-PGJ2 presente en la muestra compite frente a la molécula alcalina que tiene adherida 15d-PGJ2 (proporcionado en el kit) por la unión al anticuerpo presente en los pocillos de la placa. Posteriormente se añade el substrato, el cual desencadena una reacción enzimática que genera un producto amarillo medible a 405nm (Synergy 2, BioTek, Alemania). La sensibilidad del ensayo es de 36pg/ml.
4.11 NIVELES DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA EN CORTEZA PREFRONTAL Y
PLASMA.
La peroxidación lipídica o lipoperoxidación se refiere a una degradación oxidativa de los lípidos, es un mecanismo de daño celular usado como indicador del estrés oxidativo presente en los tejidos y las células. El malondialdehído (MDA) es un producto natural de la peroxidación lipídica, resultante de la acción de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno sobre las membranas celulares.
Una manera de evaluar los niveles de peroxidación lipídica es mediante el test del ácido tiobarbitúrico para MDA (Das y Ratty, 1987), también conocido como TBARS. Para ello, las muestras de corteza cerebral se homogenizaron por sonicación en 550µl de tampón fosfato 0,05M. Las muestras fueron desproteinizadas con ácido tricloroacético (TCA) y ácido clorhídrico (HCl). Posteriormente, se añadió ácido tiobarbitúrico (TBA) al 2% p/v en NaOH 0,5N. La mezcla se dejó reaccionar bajo altas temperaturas (90-95°C) durante 15 minutos para facilitar la formación del complejo MDA-TBA, el cual es colorimétricamente medible. Las muestras se centrifugaron a 12000g durante 15 minutos a 4°C para detener la reacción y recoger el sobrenadante rosa, el cual se midió por espectrofotometría a 532nm (Synergy 2, BioTek, Alemania). Los niveles de MDA obtenidos en las muestras fueron normalizados con la concentración proteica de cada una de ellas.
Para la medición de los niveles de MDA en plasma se utilizó un kit comercial “TBARS Assay Kit” (Ref. 10009055, Cayman Europe, Estonia), el cual también basa en la formación del complejo MDA-TBA medible a 530nm bajo condiciones ácidas y a altas temperaturas.
4.12 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE NITRITOS EN CORTEZA