Conclusiones y perspectivas
Conclusiones
generales
• La inoculación de larvas de E. aporema con AgMNPV-/acZ confirmó que este virus es incapaz de infectar a este insecto plaga. Por otra parte, en estudios previos se demostró que A. gemmatalis no es susceptible a EpapGV.
• Rachiplusia nu resultó susceptible a la infección por AgMNPV en altas dosis.
• En los ensayos de inoculación conjunta de EpapGV y AgMNPV en larvas de A.
gemmatalis se observa un incremento de la virulencia de AgMNPV cuando es administrado en forma simultánea con EpapGV. Los efectos resultaron más notorios a dosis bajas.
• La secuenciación de una región del fragmento fiamHI E del mapa físico de EpapGV, permitió obtener la secuencia completa del gen ie-1. Asimismo, se identificaron dos ORF completos, homólogos a los presentes en otros
Granulovirus. Uno tiene una alta similitud de secuencia con el ORF 12 de PxGV y el otro una alta similitud al ORF 9 de AgseGV, ambos con función desconocida. Se identificó, además, la región C-terminal del gen que codifica la quitinasa (chiA). • La región promotora del gen ie-1 de EpapGV, fue amplificada con primers
específicos y se clonó dirigiendo la expresión de los genes indicadores LacZ y
CAT. Se evaluó la funcionalidad de esta región en líneas celulares no permisivas a la infección por EpapGV, derivadas de Anticarsia gemmatalis (UFLAg-286) y de
Spodoptera frugiperda (SF-9). Los resultados obtenidos, permitieron confirmar que
el promotor de ie-1 de EpapGV es reconocido por la maquinaria transcripcional de la célula hospedante.
• Los ORF IE-1 de EpapGV y de AgMNPV fueron amplificados y clonados en un vector de expresión constitutiva. Se evaluó la autorregulación de IE-1 sobre su propio promotor y el promotor heterólogo de AgMNPV. Los ensayos de co- transfección indican que IE-1 de EpapGV puede modular la transcripción del gen homólogo de AgMNPV. Es el primer trabajo que evalúa la actividad de IE-1 de un GV.
• Se construyeron vectores en los que la expresión del gen indicador LacZ se
encuentra bajo el control de promotores tardíos de EpapGV (egt y granulina) y AgMNPV (egt y poliedrina). Se evaluó la transactivación transcripcional de estos genes en el entorno heterólogo de Anticarsia gemmatalis en presencia y ausencia de expresión de genes de AgMNPV.
• La transfección de cultivos celulares con estos plásmidos y la detección de la expresión del gen indicador permitió verificar que no se detecta expresión a partir de los promotores tardíos de EpapGV en el entorno heterólogo de A. gemmatalis. El resultado novedoso es que son transactivables por factores (celulares o virales) generados durante la infección por AgMNPV (transfección con el plásmido indicador + infección con AgMNPV).
• Se construyó un vector de transferencia con un sistema de selección positiva (pR) para la introducción de segmentos de DNA de gran tamaño en AgMNPV. Se clonaron cuatro fragmentos EcoRI del genoma de EpapGV en pR.
• Mediante SOE-PCR se construyó el vector pl2, para la producción de baculovirus
de Anticarsia gemmatalis recombinantes (poliedrina+) capaces de ser propagados tanto en cultivos celulares como en larvas del insecto. Este vector permite el clonado de genes particulares bajo el control del promotor fuerte de poliedrina.
• Se verificó el funcionamiento del sistema mediante la producción de un
recombinante que expresa la proteína fluorescente verde EGFP (rAgMNPV/g/p-
polh+) en cultivos celulares y en larvas de A. gemmatalis.
• Se clonaron tres genes de EpapGV relacionados con el proceso de infección: chiA,
efp y gp37, en pl2.
• Por co-transfección y recombinación homologa in vivo se obtuvieron AgMNPV
recombinantes (rAgMNPV) con distintos segmentos genómicos y genes particulares de EpapGV.
• Se produjo un rAgMNPV “marcado” que expresa una proteína fluorescente (rAgMNPV/egfp-polh+\ Esto permite el seguimiento de la infección en cultivos celulares y larvas. Su comportamiento biológico no parece ser diferente del virus parental AgMNPV. En este sentido, la administración conjunta de rAgMNPV/eg/p-
polh+ y EpapGV a larvas de A. gemmatalis mostró un incremento de mortalidad
Conclusiones y perspectivas
Perspectivas
Los resultados obtenidos durante los ensayos de inoculación conjunta de EpapGV y AgMNPV indican que esta mezcla provoca una disminución del TL50. Se podrían realizar bioensayos similares con dosis inferiores de EpapGV. En caso de obtenerse resultados similares, la mezcla de estos virus podría proponerse como una nueva formulación baculoviral con mayor poder insecticida.
Los ensayos de expresión transitorios de IE-1 de EpapGV indicaron una autorregulación negativa sobre su región promotora bajo las condiciones ensayadas. Es necesario identificar la región mínima promotora y evaluar la actividad de la misma en otras líneas celulares, así como la capacidad de autorregulación sobre estas zonas para corroborar los resultados obtenidos durante esta tesis.
Se debe confirmar la identidad de los virus recombinantes generados mediante
Southern blot para confirmar la correcta inserción de los genes y de los grandes fragmentos de EpapGV insertados. Asimismo, con estos ensayos se podrá verificar si se produjeron rearreglos genómicos durante el proceso de recombinación o se mantuvieron los grandes fragmentos en su totalidad. Posteriormente, se deberá evaluar la infectividad de los virus recombinantes sobre distintas especies de lepidópteros, lo cual posibilita la búsqueda de posibles determinantes genéticos implicados en el rango de hospedantes.