fusoquina FIL
4.1. Construcción y caracterización de adenovirus que expresen IP10, Lptn.
Clonación de los genes IP10 y Lptn en el genoma adenoviral.
Para la construcción y caracterización de los adenovirus se requirió de distintos pasos: (1) clonar el gen de interés dentro del plásmido pSh, (2) recombinar los plásmidos pSh y pAd, (3) caracterizar el genoma adenoviral recombinante, (4) transfectar el DNA recombinante para la producción de partículas virales y (5) probar que el adenovirus es capaz de dirigir la expresión de la proteína recombinante.
4.1.1. Clonación de los genes de interés en pSh.
Los genes para las quimiocinas IP10 y Lptn fueron enviados a sintetizar de manera individual optimizados por la compañía Eurofins mwg operon (E.U.A.).
Estos genes llegaron clonados cada uno en un plásmido pCR®2.1 (pC), de donde fue necesario subclonar para su proceso en el sistema AdEasy.
34 La estrategia de subclonación de los genes de interés consistió en liberar el fragmento del gen de interés del esqueleto del plásmido por medio de una digestión enzimática con las enzimas HindIII y XhoI. Con esta digestión se
obtuvo para el vector pCIP10 la liberación de dos fragmentos: el esqueleto del plásmido de 3.8 Kb y de el gen de interés de un tamaño de 0.445 Kb; de igual manera en la digestión del vector pCLptn se obtuvieron fragmentos de 3.8Kb para el esqueleto del plásmido y de 0.490 pb para el gen de interés; los fragmentos correspondientes con los genes de interés fueron purificados a partir del gel de agarosa (Figura 8).
pCR® 2.1 pShuttle
Figura 7. Estrategia de subclonación del vector pCR2.1 al vector pShuttle. A partir del vector pCR 2.1 se obtuvieron los genes de interés los cuales se clonaron de manera dirigida por las enzimas HindIII y XhoI, en el
35 Una vez purificados los fragmentos fueron ligados con el vector pSh previamente digerido con las enzimas HindIII y XhoI y transformados en
bacterias E. coli de la cepa DH5 calcio competentes, las cuales fueron
plaqueadas en LB agar con kanamicina, de donde se levantaron colonias resistentes a las cuales se les llevó a cabo la extracción del DNA plasmídico. El DNA se corrió en un gel para su análisis donde se pudo apreciar, tanto para pShIP10 como pShLptn, un tamaño aproximado a las 7.5 kb lo cual corresponde al tamaño del vector pSh, mientras que en los vectores pCIP10 y pCLptn, se encontró una banda de aproximadamente 4.5 kb que corresponde con los tamaños esperados; logrando así la subclonación de los genes de interés en el plásmido transbordador pShuttle (Figura 9).
Figura 8. Digestión enzimática con HindIII y XhoI en los vectores pCIP10 y
pCLptn. Carril 1, pCIP10 digerido; carril 2, pCLptn digerido. Las flechas indican la liberación del gen de interés, de 0.445 para pCIP10 y de 0.490 para pCLptn. M, Marcador de peso molecular 1 kb. Gel de agarosa al 0.8%.
0.490 kb 20 5 1.5 0.5 M 1 M 2
36 Para caracterizar los genes de interés con el vector pSh se llevó a cabo una digestión enzimática con las enzimas HindIII y XhoI, liberando las secuencias
del gen de interés ligado, de 0.445 kb para IP10 y de 0.490 para Lptn (Figura 10). kb 20 5 1.5 M 1 2 3 4 5
Figura 9. Ligación de genes de interés en el vector pShuttle. Carril 1, pCIP10; carril 2, pCIP10; carril 3, pShLptn; carril 4 pShIP10; carril 5, pShV. M,
Marcador de peso molecular. Gel de agarosa al 0.8%.
Figura 10. Caracterización de clonas con los genes de interés. Digestión enzimática con Hind III y Xho I; Carril 1, pShIP10; 2, pShLptn; M, Marcador de
peso molecular. Gel de agarosa al 0.8%.
M 1 M 2 20 5 1.5 0.5 kb
37 A la par de la caracterización enzimática se realizó un tamizaje por PCR a posibles clonas con los genes de interés. El resultado se corrió en un gel de agarosa en donde se observó que efectivamente algunas de las colonias transformadas con la ligación del gen de interés y el vector pSh presentaron amplificación. Para pShIP10 se presentó una amplificación de 0.570 kb lo cual corresponde con el tamaño del gen insertado de 0.445 kb más una sección del sitio múltiple de restricción de 0.125 kb. Para el plásmido pShLptn se observó una amplificación de 0.616 kb, que corresponde con 0.490 kb del gen de interés más el sitio múltiple de restricción. Como control positivo del ensayo se utilizó el pShFIL el cual tiene un patrón de amplificación de 0.75 kb. El control negativo del ensayo presentó amplificación debida a la presencia del sitio múltiple de clonación de 0.125 kb (Figura 11). 1.5 1 0.7 0.5 kb M 1 2 3 4 5 M 6 7 8
Figura 11. Tamizaje de clonas ligadas con los genes de interés. Carriles
1-3, clonas transformadas con la ligación de pSh y Lptn (Carril 3, clona positiva para ligación, amplificación de 0.616 kb ); carriles 6-8; clonas transformadas con la ligación de pSh y IP10 (Carril 8, clona positiva para ligación, amplificación de 0.570 kb); carril 4, Control positivo con amplificación del gen de la fusoquina FIL (0.75 kb); carril 5, control negativo. M, Marcador de peso molecular. Gel de agarosa al 0.8%.
38 4.1.2. Recombinación homóloga del plásmido pShuttle con el
vector AdEasy.
Con el fin de construir el genoma adenoviral recombinante para cada citocina, primeramente se linearizaron los vectores pShIP10 y pShLptn con la enzima
PmeI (Figura 12). Al correr las digestiones en un gel de agarosa se pudo
observar que los plásmidos recién digeridos tenían una única banda de aproximadamente 7.5 kb lo cual corresponde con una digestión completa de los plásmidos.
El producto de cada digestión fue co-transformado en bacterias de la cepa BJ5183 de E. coli. Se observó que para al menos 2 de cada 5 colonias
levantadas por construcción (pShIP10, pShLptn y pShV) presentaban un DNA plasmídico único con un tamaño aproximado de 34 kb al correrlo en un gel de agarosa (Figura 14); lo cual corresponde con la correcta recombinación de los plásmidos pSh y pAd.
20
5
1.5
kb M 1 2 3 4 5 6
Figura 12. Linearización de los vectores pShuttle acarreando los genes de interés. Digestión con la enzima Pme I. Carril 1, pShIP10; carril 3,
pShLptn; carril 5, pShV. M: Marcador de peso molecular. Gel de agarosa al 0.8%.
39
Figura 13. Obtención de clonas recombinantes de pSh y pAd. Carriles 1-5, recombinantes pAdIP10; carriles 6-10, recombinantes pAdLptn; carriles 11-15, recombinantes pAdV; M, Marcador de peso molecular 1kb. Las flechas indican las clonas seleccionadas para cada proceso de recombinación. Gel de agarosa al 0.8%.
4.1.3. Caracterización del genoma adenoviral recombinante. La caracterización del genoma adenoviral recombinante se llevó a cabo realizando una digestión enzimática con la enzima Pac I.
Tanto para la construcción del genoma adenoviral pAdIP10 (carriles 3 al 7, Figura 14) como para la construcción del genoma adenoviral pAdLptn (carriles 10 al 15, Figura 14) se pudo observar que de las colonias seleccionadas, el 80% de las clonas fueron positivas para la recombinación; de donde 3 clonas positivas se habían recombinado utilizando los brazos homólogos (caracterizado por la liberación de dos fragmentos un mayor a 20kb y otro de 4.5 kb). Para la construcción del genoma pAdV sólo el 50% de las colonias fueron positivas para la recombinación; todas clonas recombinadas para pAdV
40 se encuentran utilizando los brazos homólogos para su recombinación (carriles 15 al 21, Figura 14).
4.1.4. Producción de partículas virales.
Con el fin de producir partículas virales se utilizaron las construcciones del genoma adenoviral recién construidas y caracterizadas para llevar a cabo la transfección de las células HEK293. A las células transfectadas se les realizaron observaciones diarias en busca de efecto citopático (CPE), el cual se observó entre los 7 y 10 días post-transfección para los plásmidos transfectados pAdIP10 (clonas 1 y 2), pAdLptn (clonas 1 y 2) y pAdV. El control positivo del ensayo consistió de la transfección del plásmido pAdGFP, del cual se corroboró que existía expresión de la proteína fluorescente a partir del día 5. El control negativo durante este periodo no presentó efecto citopático (Figura 15).
kb 20 5 1.5 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 21
Figura 14. Caracterización de clonas recombinantes. Carriles 3-7, clonas recombinantes de pAdIP10; carriles 10-15, clonas recombinantes de pAdLptn; carriles 16-21, clonas recombinantes de pAdV; M, Marcador de peso molecular 1 kb. Las flechas indican la liberación de fragmentos de 3 kb y 4.5 kb generados por la recombinación homóloga. Gel de agarosa al 0.8%.
41
Día 1 Día 5 Día 7 Día 10
Control – pAdIP10 1 pAdIP10 2 pAdLptn 1 pAdLptn 2 pAdGFP pAdV
Figura 15. Proceso de transfección de las células HEK293. Observaciones de las células HEK transfectadas con los diferentes tratamientos en los días 1, 5, 7 y 10. El control AdGFP se corroboró su expresión a partir del día 5 (10X).
42 Dado el efecto citopático presentado por las células transfectadas y que el sobrenadante de éstas fue capaz de infectar nuevas células es posible concluir hasta este punto que ya se cuenta con los adenovirus AdIP10 y AdLptn.
4.1.5. Cuantificación de partículas virales .
Utilizando los sobrenadantes infectivos de cada virus se amplificó la infección y se purificaron las partículas adenovirales. Los adenovirus fueron cuantificados con dos métodos: un método físico obteniendo para los diferentes adenovirus valores de entre 8x1010 a 1x1011; sin embargo al cuantificar las partículas adenovirales por un método biológico el número de partículas infectivas fue significativamente menor; los valores se presentan en la Tabla 2. Conociendo el título adenoviral obtenido se procedió con los experimentos siguientes utilizando la concentración de 1 X106 por tratamiento, la cuál es la máxima posible a utilizar por la limitación de las partículas adenovirales infectivas.
Tabla 2. Cuantificación de adenovirus.
Adenovirus VP PFU/ml
AdIP10 1.1γ x1011 1.6 x107 AdLptn 8.γγ x1010 7.9 x107 AdFIL 1.15 x1011 7.9 x106
AdV 1.19 x1011 γ.β x108
VP, partículas virales obtenidas por el método físico de cuantificación; PFU/ml, Unidades formadoras de placa por militro obtenidas por el método biológico.
43 4.1.6. Los adenovirus recombinantes son capaces de producir las
proteínas de interés.
Para determinar si los adenovirus recombinantes son capaces de dirigir la expresión de las proteínas de interés IP10 y Lptn, a partir de una infección de células HEK293 se obtuvieron los sobrenadantes los cuales se analizaron mediante Western Blot usando anticuerpos específicos contra IP10 (Figura 16 A) o Lptn (Figura 16 B) humanas. Ambos geles se cargaron de manera idéntica.
La fusoquina FIL se cargó en el carril 1 (Figura 16) funcionando como un control positivo, la cual presenta señal con un peso aproximado a los 22 kDa (Sánchez- Lugo, 2011). La producción de quimiocina por AdIP10 sólo fue detectada en la Figura 16 A; en donde se observó una banda con señal intensa con un peso aproximado a los 10 kDa. Mientras que la producción de la quimiocina por AdLptn solo se detectó en la Figura 16 B, con una señal bien delimitada con un tamaño aproximado a los 12 kDa. Para el experimento se utilizaron dos controles negativos uno conformado por el sobrenadante de células infectadas por el adenovirus vacío y otro conformado por sobrenadante de células sin infectar; ambos controles no fueron detectados por los anticuerpos utilizados. Con este experimento pudimos comprobar que los adenovirus fueron capaces de dirigir la expresión de las proteínas recombinantes.
44