Crecimiento bajo diferentes condiciones de estrés

En una fermentación alcohólica para la producción de vino y sidra, las células de levaduras están bajo diferentes condiciones de estrés. Al inicio del proceso de producción los factores de estreses son el osmótico, ocasionado por una alta concentración de glucosa y un pH muy bajo. Y al final de la fermentación alcohólica se presenta estrés por alcohol y bajo contenido en nitrógeno. Las condiciones de estrés en las bebidas tradicionales de Perú son un poco diferentes teniendo en cuenta el proceso. La concentración de azúcares en estos procesos al inicio de la fermentación es de 85 g/L, muy por debajo de lo que se encuentra en mosto de uva que oscila entre 180 a 250 g/L; el pH en la pasta de yuca y masa de maíz no se puede considerar una condición estresante ya que es de 4,5 frente a 2,9 a 3,2 en vinos. Es decir, las levaduras de masato y chicha de jora no tienen que crecer en condiciones tan extremas como las vínicas. Sin embargo, para comparar la capacidad de adaptación a estrés de las levaduras aisladas de masato y chicha de Jora con la de cepas vínicas de S. cerevisiae, se evaluó la tolerancia a cuatro condiciones de estrés, pH bajo, alta concentración de azúcar, temperatura y etanol tanto con las cepas aisladas de masato y chicha de jora como las cepas control.

La Tabla 1.14 muestra la capacidad de crecer de las cepas en las diferentes condiciones de estrés evaluadas. El desarrollo de la colonia en la sexta dilución está indicada por el número 6, en la quinta dilución por el 5 y así hasta la primera dilución con el número 1. El número 0 indica que la cepa no tolera la condición de estrés y no hay crecimiento. La tolerancia a un pH bajo se determinó al observar el desarrollo de las colonias sobre los medios de cultivo a pH 2,8; 3,0 y 3,2 después de 24 h de incubación a 30ºC. En general, las cepas de masato y chicha de jora crecieron en todas las diluciones a los tres pH ensayados. Los resultados obtenidos muestran una tolerancia similar al bajo pH entre las cepas de chicha y de masato y las cepas vínicas, aún cuando el pH del masato y chicha esta cercano a 5. Las mismas observaciones se detectaron con el estrés osmótico, es decir, todas las cepas de Saccharomyces de masato, chicha, vínicas comerciales de S. cerevisiae y S. bayanus

evaluadas, presentaron un crecimiento en los medios de cultivo con 200, 250 y 300 g/L de glucosa después de una incubación de 24 h a 30ºC.

Una de las principales diferencias observadas entre las cepas es la capacidad de crecer a diferentes temperaturas y la tolerancia a etanol. El crecimiento de las cepas de S. cerevisiae de masato y chicha, así como las vínicas, se evaluaron al crecerlas en medio GPYA incubado a 10, 16, 30 y 37ºC para evaluar la tolerancia a bajas y altas temperaturas. El crecimiento a 30°C y 37ºC se registró a las 24 h de incubación, a 16ºC después de 3 días y a 10ºC después de 6 días de incubación. Los resultados obtenidos muestran que todas las cepas analizadas crecieron a 16, 30 y 37ºC; sin embargo, solo las cepas de S. bayanus lograron crecer a 10ºC y fueron capaces de formar colonias en todas las diluciones evaluadas. Las cepas de masato y las vínicas sólo crecieron en las primeras 3 diluciones. Cabe destacar que las cepas de chicha de jora lograron crecer en las cuatro primeras diluciones, excepto las cepas 13, 14, 15, 16 y 26 que crecieron hasta la quinta dilución y las cepas 22 y 29 que solo crecieron hasta la tercera dilución; mientras que las cepas vínicas de S. cerevisiae ensayadas no fueron capaces de crecer en la cuarta dilución a 10°C.

Otra diferencia fisiológica detectada es la capacidad de crecer a 42ºC. En este caso sólo las cepas de masato (1, 6 y 12) crecieron en todas las diluciones, y todas las de chicha de jora (excepto la 14, 16, 25, 26, 27 y 28) no crecieron hasta la quinta y/o sexta dilución. Cabe resaltar que la capacidad de crecer a 42°C solo se observó en las cepas peruanas, pero no se ha observado en las cepas vínicas. Probablemente esta característica esté asociada al proceso fermentativo que se realiza de forma muy tradicional donde no se controla la temperatura y en zonas donde la temperatura ambiente puede alcanzar 42ºC (Riofrío et al., 2003).

Otra característica importante para una fermentación alcohólica es la tolerancia a etanol, y aquí también se encontraron diferencias entre las cepas estudiadas. El crecimiento de las cepas de Saccharomyces se estudió en condiciones de estrés por etanol en GPYA con 10, 12 y 15% de etanol. Los resultados obtenidos muestran que todas las cepas de Saccharomyces

evaluadas fueron capaces de crecer con 10% de etanol en todas las diluciones, excepto las cepas 17 y 27 aisladas de chicha, que presentaron un crecimiento hasta la cuarta y quinta dilución. Al igual que en el caso de la temperatura estas diferencias pueden estar asociadas al proceso.

Todas las cepas de S. cerevisiae comerciales y las de masato crecieron en GPYA con 12% de etanol en la mayoría de las diluciones (hasta quinta o sexta dilución) y se consideraron tolerantes al etanol. Las cepas de chicha mostraron un comportamiento específico para cada cepa, así nueve cepas resultaron tolerantes a etanol, al desarrollar colonias en la quinta o sexta dilución; pero otras cinco, no crecieron más allá de la cuarta dilución, por lo que se consideraron sensibles al etanol. Ninguna de las cepas de S. bayanus mostró crecimiento hasta la sexta dilución, por lo que se consideraron como cepas más sensibles que las de masato (Tabla 1.14).

En el medio GPYA con 15% de etanol también se observó un comportamiento específico para cada cepa. La mayoría de las cepas vínicas y de masato fueron capaces de crecer hasta la quinta o sexta dilución, excepto la cepa vínica Fermiblanc Arom que creció solo hasta la segunda dilución, y la número 11 de masato, que no creció en ninguna dilución. Las cepas de S. bayanus no crecieron, excepto la cepa CECT12930 que creció hasta la quinta dilución

Entre las cepas de bebidas tradicionales de Perú y las vínicas no se detectaron diferencias en la tolerancia a pH bajos y altas concentraciones de glucosa, pues todas desarrollaron colonias en la sexta dilución. En relación a estrés por temperatura se encontró que las cepas de masato toleran bajas temperaturas en forma semejante que las cepas vínicas. En cambio, las cepas aisladas de chicha resultan más tolerantes a bajas temperaturas que las de masato y un poco menos que las S. bayanus, ya que lograron crecimiento de colonias hasta la cuarta y quinta dilución.

Tabla 1.14. Tolerancia a pH, glucosa, temperatura y etanol, como factor de estrés de los aislados de S. cerevisiae de bebidas tradicionales de Perú, indicado por los números desde el 0 (sin crecimiento) a 6 (desarrollo de la colonia en la dilución 6). El color del resaltado del número indica el crecimiento, bueno (verde), regular (amarillo) y malo (rojo). 1: Las diferentes cepas corresponden a cada uno de los patrones de restricción obtenidos por RFLP del mtDNA.

pH Glucosa _(gl-1₎ Temperatura _(ºC) Etanol _(%)

Cepa1 2,8 3,0 3,2 200 250 300 10 16 30 37 42 10 12 15 1 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 6 6 2 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 3 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 6 6 7 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 8 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 5 5 9 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 3 6 6 6 10 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 5 11 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 0 6 6 0 12 6 6 6 6 6 5 2 6 6 6 6 6 6 2 13 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 5 6 5 0 14 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 0 6 5 0 15 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 4 0 16 6 6 5 6 6 6 5 6 6 6 2 6 0 0 17 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 4 4 0 18 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 0 19 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 2 20 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 0 21 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 0 22 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 6 0 23 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 3 0 24 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 0 25 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 0 6 4 0 26 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 0 6 0 0 27 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 2 5 3 0 28 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 0 6 2 0 29 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 6 6 6 6 Lalvin T73 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 6 Uvaferm 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 6 5 Fermiblanc 6 6 6 6 6 6 3 6 6 6 0 6 5 2 CECT12638 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 6 4 0 CECT12669 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 6 3 0 CECT12930 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 6 5 5

Bajo un estrés por altas temperaturas, las cepas de bebidas tradicionales de Perú resultaron ser más tolerantes, al lograr un crecimiento hasta la sexta dilución, mientras que las cepas controles no crecieron en ninguna dilución. Por último, las cepas de masato toleran más el etanol que las cepas de chicha, al igual que las cepas vínicas. Al considerar la tolerancia a los estreses osmótico y por pH, se observa que las cepas de masato y chicha de jora toleran las condiciones de una fermentación vínica.

Se identificaron a las cepas 1 y 6 de masato y la 29 de chicha como las cepas más adaptadas a variaciones en la temperatura de crecimiento, ya que se detectó el desarrollo de colonias en todas las diluciones bajo todas las condiciones de estrés, excepto a una temperatura de 10°C que formaron colonias en la tercera dilución. Sin embargo, son más tolerantes que las cepas comerciales utilizadas como controles, pues las vínicas de la especie S. cerevisiae no crecen a 42°C y las S. bayanus no forman colonias a altas temperaturas (37 y 42°C) y no toleran altas concentraciones de etanol. Con estos datos se puede concluir que las cepas de chicha y de masato presentan adaptaciones fisiológicas para llevar a cabo una fermentación vínica, es decir, son capaces de tolerar las condiciones tan estresantes de una fermentación vínica. Además con análisis filogenético del capitulo 2, se demuestra que las cepas de Perú presentan alelos detectados en las cepas aisladas de vino, lo que confirma la sospecha de que son capaces de llevar a cabo una fermentación vínica.