Cuantificación de levaduras alterantes en el alimento.

Un aspecto importante en los programas de prevención de alteración de alimentos es la posibilidad de realizar una cuantificación de las levaduras a partir de una muestra, y así poder estimar el riesgo de contaminación del alimento por una determinada especie de levadura.

Tradicionalmente se han utilizado los métodos de recuento en placa para la enumeración de levaduras. Sin embargo, aunque estas técnicas son sencillas y están ampliamente aceptadas, resultan largas y tediosas. Alternativamente, el desarrollo de técnicas rápidas, descritas previamente en el apartado 3.2, ha permitido realizar una enumeración más precisa, sensible y reproducible. Algunos trabajos muestran la validez de las técnicas automatizadas como Petrifilm o SimPlate. A modo de ejemplo, Taniwaki y colaboradores (2001) muestran una buena correlación entre los recuentos de levaduras

Introducción obtenidos mediante recuento en placa y el método Petrifilm, mientras que no obtuvieron buenos resultados con el método SimPlate. Por otra parte, la técnica de microscopía de epifluorescencia ha sido aplicada para el recuento de levaduras del género

Brettanomyces a partir de muestras de vino. Así, Millet y Lonvaud-Funel (2000)

mostraron una baja correlación de este método con el recuento en placa. Alternativamente, la citometría de flujo se ha comparado con métodos estándar para valorar los cultivos de levaduras presentes en productos de panadería, vino y sidra (Bruetschy y col., 1994; Dinsdale y col., 1995; Jespersen y Jacobsen, 1994). Malacrino y colaboradores (2001), observaron una buena correlación entre los recuentos obtenidos en placa y los recuentos por citometría de flujo para las especies S. cerevisiae y S.

bayanus en fermentaciones de mosto. Sin embargo, los límites de detección de estas

levaduras fueron muy altos, 103 _{UFC/mL. Estos mismos niveles fueron determinados por} Jespersen y colaboradores (1993) en levaduras alterantes de cerveza

Recientemente, un estudio realizado por García y colaboradores (2004), permitió evaluar la técnica de ELISA con anticuerpos policlonales frente a técnicas genéticas basadas en PCR, para la enumeración de levaduras viables en productos lácteos. Los resultados obtenidos mostraron limitaciones del uso de inmunoensayos para la detección de 10 especies diferentes de levaduras alterantes, mientras que la amplificación por PCR de la región 18S rRNA permitió detectar niveles más bajos, aunque recurriendo a enriquecimientos de la muestra.

A pesar de que estas técnicas han supuesto una mejora en cuanto a la rapidez, y reproducibilidad de la cuantificación de levaduras alterantes de alimentos, en muchas ocasiones la sensibilidad obtenida no satisface las necesidades de la industria alimentaria. Como se describe en el apartado 1.4, muy pocas células pueden causar alteración, por lo que se necesitan técnicas más sensibles, que permitan la detección y enumeración precisa de las levaduras en el alimento. La introducción de la PCR a tiempo real ha supuesto una revolución en el campo del diagnóstico molecular. Las ventajas de su uso frente a otras técnicas se basan fundamentalmente en su sensibilidad, rapidez y posibilidad de realizar una detección del microorganismo de forma cuantitativa. Esto ha supuesto una rápida expansión con numerosas aplicaciones. Entre ellas, la enumeración de microorganismos con interés clínico ha sido muy utilizada. En concreto, la cuantificación de levaduras patógenas, pertenecientes a especies tales como C. albicans,

C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. glabrata y C. lusitaniae, se ha aplicado con

éxito (Brinkman y col. 2003; Frade y col., 2004; Loeffler y col., 2000). Sin embargo, hasta el momento existen pocos trabajos centrados en la detección cuantitativa de levaduras alterantes directamente en el alimento (Tabla 7). Bleve y colaboradores (2003),

Introducción

desarrollaron un protocolo de aproximadamente 10 horas para la cuantificación de levaduras contaminantes de yogurt y productos pasteurizados. Mediante diluciones de mRNA de actina procedente de cultivos mixtos de levaduras y hongos, obtuvieron una buena correlación entre el número total de células y las señales fluorescentes, consiguiendo una linealidad en 6 órdenes de magnitud. La comparación entre valores de recuento por placa y mediante el ensayo de RT-PCR a tiempo real fue también positiva. Sin embargo, aunque se obtuvo una buena sensibilidad (25 pg RNA/µL o 10 UFC/mLde

S. cerevisiae), el método no permite la diferenciación entre las distintas especies de

levaduras alterantes de alimentos pasteurizados. Por otra parte, Casey y Dobson (2004) construyeron una curva patrón a partir de diluciones de un fragmento amplificado del gen de la citrato sintasa (CS1), para la cuantificación de la especie C. krusei en zumo de manzana. Sin embargo, los resultados no valoran la cuantificación de muestras con pocas células.

Finalmente cabe destacar los estudios recientes aplicados a la enumeración de levaduras alterantes en vinos. Los escasos trabajos se han centrado en la especie D.

bruxellensis. Así, Phister y Mills (2003) cuantificaron en vino la contaminación producida

por D. bruxellensis mediante un protocolo de 3 h utilizando SYBR Green. A partir de muestras con contaminación real, la correlación obtenida entre recuento en placa y PCR a tiempo real fue excelente. Delaherche y colaboradores (2004) también analizaron la contaminación de vinos por D. bruxellensis. Sin embargo, se obtuvo baja sensibilidad, por lo que los recuentos fueron como mínimo del orden de 105 _{células de D. bruxellensis} en muestras contaminada.

Objetivos La importancia de las levaduras se conoce desde hace mucho tiempo y con el desarrollo de la industria, se están utilizando no sólo para la elaboración de un gran número de productos fermentados (cerveza, vino, quesos y embutidos), sino también para la producción de antibióticos, vitaminas, enzimas, etc. Por otra parte, las levaduras tienen también un aspecto negativo ya que son capaces de alterar los alimentos. Aunque dicha alteración no supone un riesgo para la salud, si que implica pérdidas económicas importantes para las industrias. De aquí el interés por parte de las industrias de alimentos para extremar las medidas de control al respecto. Dichas medidas pueden variar desde el desarrollo de nuevos métodos de conservación, hasta la detección rápida de especies y cepas de levaduras alterantes. Puesto que el interés por las levaduras como alterantes de los alimentos es relativamente reciente, este constituye un campo de investigación con muchas posibilidades. En el presente trabajo se abordan aspectos relacionados con la identificación y caracterización molecular de algunas de las especies típicamente alterantes. La idea es proporcionar a las industrias sistemas nuevos de identificación rápida de levaduras así como mostrar, con ejemplos concretos, la utilidad de la aplicación de las técnicas moleculares para resolver problemas a nivel industrial.

Estas consideraciones nos llevaron a plantear los siguientes objetivos en la presente Tesis Doctoral:

1. Identificación de levaduras del género Debaryomyces mediante secuenciación.