Los brotes obtenidos se cortaron en secciones de 1 entrenudo y se les retiró las hojas en campana de flujo laminar con la ayuda de pinzas, bisturí y placa petri; de forma que en un futuro queden mínimo 2 nudos enterrados en el medio base y otros 2 queden expuestos. Los entrenudos se traspasaron a 7 recipientes de vidrio con medio de cultivo líquido MS cada uno con un tratamiento distinto. Se utilizó un grupo control, al cual no se le añadió ninguna fitohormona en el medio líquido pero que siguió el mismo procedimiento con el fin de homogeneizar la experimentación. A los grupos 2, 3 y 4 se les añadió un suplemento al medio base líquido de 1 mg/L, 10 mg/L y 100 mg/L de la auxina 2,4-D, respectivamente. Por otro lado, a los grupos 5, 6 y 7 se les administró en el medio base 1 mg/L, 10 mg/L y 100 mg/L respectivamente de la citoquinina TDZ. Los 7 grupos de entrenudos permanecieron en suspensión y en agitación a 90 rpm durante 24 horas, de las cuales 16h fueron con luz y 8h fueron en oscuridad. Este procedimiento se lleva a cabo para exponer los brotes a “pulsos” de fitohormonas de muy corta duración.
Más adelante se evaluará qué resultados conlleva este proceso.
4.3 Crecimiento de los entrenudos
Al día siguiente, bajo una campana de flujo laminar, se secan los explantes con papel de filtro para retirar los residuos de fitohormonas presentes en el cultivo líquido anterior y se realiza un lavado en un medio líquido MS sin reguladores durante 10 minutos en agitación. Una vez realizado el lavado, los explantes son trasladados a tubos de vidrio con tapón aptos para cultivo in vitro (2,5 cm de diámetro, 15 cm de alto), los cuales contienen medio sólido MS (solidificado con agar 7’5 g/L) sin reguladores. Los tubos con las muestras se dejaron incubar durante 6 semanas para dar tiempo a que se lleve a cabo un crecimiento observable. Las condiciones de crecimiento fueron las anteriormente mencionadas en el proceso de micropropagación de batata. Pasado este tiempo, se volvió al laboratorio para observar el efecto que tuvo el procedimiento sobre el crecimiento de
5. CRONOGRAMA
6. RESULTADOS
● Grupo control
El grupo control muestra un patrón de crecimiento normal.
Figura 10: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento sin exposición a fitohormonas exógenas.
● Tratamiento 2,4-D
- 1 mg/L 2,4-D
La administración de esta concentración de 2,4-D indujo la formación de callos nodulares.
Figura 11: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 1 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- 10 mg/L 2,4-D
Al exponerla a una concentración un orden de magnitud mayor se desata una respuesta más fuerte aparente al observar las mayores dimensiones del callo.
Figura 12: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 10 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- 100 mg/L 2,4-D
A un nivel tan alto de concentración, la auxina tuvo un efecto inhibitorio del crecimiento debido a sus propiedades tóxicas, aunque aún se observa un vestigio de crecimiento calloso.
Figura 13: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 100 mg/L de la auxina 2,4-D durante 24 h.
- Comparación de los tratamientos con 2,4-D
Figura 14: Comparación visual del efecto morfológico que ha tenido la exposición a diferentes concentraciones de 2,4-D en los grupos 2 y 3 respecto al control.
● Tratamiento TDZ
- 1 mg/L TDZ
Al exponer los explantes a esta baja concentración de TDZ se observa un efecto inductor de la brotación-
Figura 15: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 1 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- 10 mg/L TDZ
A la concentración de 10 mg/L de TDZ se hace aparente un efecto inhibitorio del crecimiento.
Figura 16: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 10 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- 100 mg/L TDZ
De nuevo, a concentraciones tan altas de TDZ se ha inhibido el crecimiento.
Figura 17: Explantes de batata con 6 semanas de crecimiento después de recibir un pulso de 100 mg/L de la citoquinina TDZ durante 24 h.
- Comparación de los tratamientos con TDZ
Figura 18: Comparación visual del efecto morfológico que ha tenido la exposición a diferentes concentraciones de 2,4-D en los grupos 2 y 3 respecto al control. 1→ 0 mg/L TDZ, 5 → 1mg/L TDZ, 6→ 10 mg/L TDZ, 7→ 100 mg/L TDZ.
● Brotación por cada tallo propagado
Tabla 1: Recuento de tallos brotados por cada explante de los grupos control (sin reguladores), 5 (con 1 mg/L TDZ), 6 (10 mg/L TDZ) y 7 (100 mg/L TDZ).
● Análisis estadístico comparando el número de tallos respecto a la exposición con TDZ
Figura 19: Diagrama de barras que muestra las medias de tallos por muestra de cada grupo. Se compara el grupo control con el grupo que recibió 1 mg/L de la citoquinina TDZ. Se realizó un análisis estadístico ANOVA con la herramienta de análisis de datos del programa Excel con el resultado de un p valor = 0,0028 (<0,05), siendo n = 7 por cada grupo. La varianza es de 0 en el
7. DISCUSIÓN
7.1 Efectos de la auxina 2,4-D
Como se puede observar en la figura 11, no hay crecimiento de raíces, hojas o tallos. El único crecimiento que se ha llevado a cabo es en forma de callos. Este tipo de crecimiento contrasta drásticamente con el que ha tenido el grupo control (figura 10), haciendo evidente el cambio morfológico que ha producido el hecho de exponer los entrenudos del grupo 5 a 1 mg/L de 2,4-D durante 24 horas. Durante el desarrollo normal, se da lugar a la organogénesis, proceso por el cual los tejidos se diferencian y forman estructuras funcionales como pueden ser las hojas o las raíces. Sin embargo, la exposición a bajas concentraciones de 2,4-D ha producido un proceso de desdiferenciación, siendo evidente en la aparición de callos desdiferenciados en los brotes del grupo 5. Este efecto callogénico de 2,4-D sobre plantas en desarrollo se ha reportado en muchas especies, entre ellas el trigo (Mendoza y Kaeppler, 2002), donde además se reporta la capacidad de regenerar una planta entera a partir de estos callos con el tratamiento hormonal adecuado.
La exposición a esta auxina provoca una serie de divisiones mitóticas en las células madre del tejido, produciendo la aparición de los callos (Freire, 2003) El proceso donde a partir de células somáticas somos capaces de dar lugar a un embrión sin la fusión de gametos se conoce como embriogénesis somática, y éste proceso se ha podido llevar a cabo a partir de callos generados en cualquier parte de la planta (Copeland y McDonald, 1995) Esto abre una ventana de posibilidades muy grande, ya que se podría utilizar para realizar modificaciones genéticas en estas células indiferenciadas para más tarde regenerar y replicar los clones, o se podría diferenciar estas células manipulándolas mediante reguladores para obtener un tejido u órgano concreto. La estructura más granular de los callos producidos por el grupo 5 (figura 11) puede sugerir que sí puedan ser usados como precursores para la embriogénesis somática (Blazquez et al.,, 2009). Sin embargo, otros estudios serían requeridos para comprobar que de verdad tienen esta capacidad y hasta qué punto podría usarse en el laboratorio. Cabe destacar que el tratamiento con 2,4-D puede haber generado una variación genética en los tejidos, aunque cabría esperar que este efecto se haya minimizado debido a la corta exposición de las muestras con la auxina.
Por otro lado, en el grupo 3 de brotes (figura 12), el cual se expuso a 10 mg/L de 2,4-D durante 24 horas, también se ha producido un proceso de desdiferenciación, mostrando un crecimiento de callo unas 4 veces mayor que el grupo 2. Sin embargo, en apariencia parece más “acuoso”, por lo que parece menos embriogénico que los callos más granulares del grupo 2 y puede que no sean adecuados para los procesos de embriogénesis somática anteriormente mencionados, además de que una mayor exposición a 2,4-D puede haber generado una mayor variación genética . De nuevo, se necesitaría realizar más estudios para conocer el potencial de estos explantes y si su genoma está dañado.
Finalmente, observando el grupo 4 (figura 13), nos damos cuenta de que la exposición a 100 mg/L de 2,4-D resultó tóxica para esta especie debido a que no se aprecia prácticamente crecimiento. Por lo general, grandes concentraciones de auxinas resultan tóxicas para las plantas (Cline, 1996).
La forma tradicional de exponer un cultivo a una auxina era mediante su aplicación en el medio de cultivo donde crecerá. En nuestro caso, la exposición fue tan solo durante 24 horas y después se utilizó un medio de cultivo normal MS para su crecimiento. Para conseguir los cambios morfológicos vistos en los grupos 2 y 3 (figura 14) utilizando el método tradicional, tomaría entre 4 y 6 semanas de exposición, mientras que en nuestro caso conseguimos el mismo resultado con solo un día de exposición (Carvalho et al., 1997).
7.2 Efectos de la citoquinina TDZ
La figura 15 muestra el resultado de administrar 1 mg/L de TDZ durante 1 hora a los explantes. Se puede apreciar cómo hay un mayor número de tallos respecto al grupo control (tabla 1). Además, la diferencia en las medias de los tallos por explante resulta
un efecto menos morfogénico sobre los entrenudos explantados, promoviendo la proliferación axilar. (Singh y Sayamal, 2001). Los tallos tienen una apariencia más pequeña en el grupo 5 debido a que al haber múltiples tallos en el mismo medio, éstos compiten por los recursos disponibles. Esto no supone un problema, ya que los tallos pueden ser propagados individualmente a un medio normal para que cada uno de ellos dé lugar a una planta. También se observa cómo la génesis de raíces se encuentra algo reducida en el grupo 5 respecto al control. Esto se debe a que la planta pone su esfuerzo en la creación de nuevos tallos en lugar de expandir las raíces. De hecho, la producción de raíces detendría la multiplicación de los explantes. En este tratamiento no hay formación de callo, por lo que se descarta la posibilidad de que éste pueda crear variación genética o crecimiento adventicio.
El tratamiento de TDZ a concentración 1 mg/L durante 24 horas parece una forma muy eficiente de conseguir un gran índice de multiplicación de plantas de Ipomoea batatas debido a su gran capacidad embriogénica (Ahmad y Faisal, 2018). Utilizando este método, se podrían micropropagar grandes cantidades de esta planta en un corto período de tiempo, lo cual puede resultar beneficioso tanto para el cultivo agrícola de batata como para la investigación.
Por otro lado, los tratamientos de 10 mg/L (figura 16) y 100 mg/L (figura 17) no resultaron en ningún tipo de crecimiento. De igual forma que sucede con las auxinas, las citoquininas también resultan tóxicas a concentraciones mayores (Grabkowska et al., 2014), por lo que en estos casos se detuvo por completo el desarrollo de la planta dejando la concentración aproximada de 1 mg/L como la más viable (figura 18).
De nuevo, cabe mencionar que este procedimiento podría llegar a optimizarse si se experimenta con rangos de valores más cercanos a 1 mg/L sin llegar a exceder los 10 mg/L (para evitar el efecto tóxico) ya que cabe la posibilidad de que 1 mg/L no sea el valor con mayor tasa de multiplicación para Ipomoea batatas aunque sí que lo sea de entre las concentraciones elegidas para este proyecto.
8. CONCLUSIONES
Las conclusiones de este proyecto son las reflejadas a continuación:
1. Una corta exposición a los reguladores TDZ y 2,4-D en Ipomoea batatas produce efectos morfogénicos, por lo que no es necesario exponer los cultivos a estas sustancias por tiempos prolongados, potencialmente mejorando la viabilidad de éstos.
2. Las concentraciones, tanto de TDZ como de 2,4-D, que mostraron resultados más potencialmente interesantes fueron de 1 mg/L en ambos casos.
3. 2,4-D provocó un efecto altamente desdiferenciador sobre Ipomoea batatas. Por otro lado, el efecto de TDZ provocó una brotación axilar.
CONCLUSIONS
The conclusions learned from this project are as below:
1. A short exposition of the regulators TDZ and 2,4-D on Ipomoea batatas produces morphogenic effects, meaning that it is not necessary to expose the plants to this substances for long periods of time, potentially weakening their viability.
2. The concentrations that showed more potentially interesting results were 1 mg/L both in TDZ and in 2,4-D.
3. 2,4-D induced an highly dedifferentiative effect on Ipomoea batatas. On the other hand, the effect of TDZ induced axillary sprouting.
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