CAPÍTULO 3: Metodología y desarrollo del modelo matemático
3.3 Desarrollo experimental
Se realizaron pruebas experimentales de separación de fases para sistemas PEG-sal- agua sin extracto crudo de proteína. Los resultados se muestran en el Apéndice B. Al añadir a estos sistemas puros extracto crudo de proteína, se observó que tanto el perfil como el tiempo final de separación se ven afectados por la presencia del extracto.
Esto lleva a la necesidad de realizar ajustes al modelo de separación de fases en ATPS considerando a la proteína a separar.
El objetivo de esta sección es presentar los métodos experimentales requeridos para obtener la información necesaria, que permita ajustar el modelo de separación de fases
Capítulo 3 Metodología y desarrollo del modelo matemático
acuosas para sistemas PEG-sal-extracto crudo de proteína como se presenta en la metodología.
a) Condiciones experimentales
Los experimentos se realizaron para un sistema PEG de peso molecular 1000 + solución de sales de fosfato + extracto de proteína b-ficoeritrina (BPE, por sus siglas en inglés), a una temperatura de 25°C y a un pH de 8.0. La selección de las condiciones y características del sistema experimental se realizó considerando los trabajos realizados por Benavides and Rito-Palomares (2004).
La solución de sales de fosfato consistió en una mezcla de cantidades apropiadas de K2HPO4 y KH2PO4 con la finalidad de obtener el pH deseado.
A fin de considerar el efecto de los parámetros del sistema tales como la concentración de PEG y sal y la relación de volumen de fases, Vr, se seleccionaron puntos experimentales a lo largo de tres distintas líneas de corte, TLL: 29.48, 38.5 y 42.93 % peso, en la región donde la fase rica en PEG (fase superior) es la fase contínua (zona a la izquierda del punto de inversión). Cada punto tiene una diferente composición inicial de PEG y fosfato
) ( i
m
w , pero un mismo porcentaje en peso de extracto de BPE.
En la Figura 3.2 se muestra el diagrama de fases construido a partir de datos de equilibrio reportados por Snyder et.al. (1992), así como la localización de cada uno de los puntos experimentales. En la Tabla 3.1 se presentan las composiciones de cada punto experimental, así como sus composiciones al equilibrio en la fase superior y la fase inferior.
Figura 3.2 Diagrama de fases para sistemas PEG 1000-K2HPO4 @ 25° C, pH =8.0
Diagrama de fases para sistemas PEG 1000 - K2HPO4 @ 25 °C, pH = 8.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 (%w/w) K2HPO4 (% w /w ) P E G 1 00 0
Tabla 3.1 Composiciones de los puntos experimentales PEG 1000 - K2HPO4,
Capítulo 3 Metodología y desarrollo del modelo matemático
b) Procedimientos analíticos
Para crear el sistema experimental se prepararon soluciones stock de PEG 1000 al 60 % peso y de sales de fosfato al 40% peso. Para preparar la solución stock de sales de fosfato se utilizó una mezcla de 78.03 % mol de K2HPO4 y 21.97 % mol de KH2PO4 según
la indicación de Peng et al. (1994) para lograr un pH cercano a 8.0. Ajustes finos de pH para ambas soluciones se realizaron añadiendo ácido ortofosfórico (1 M) o hidróxido de sodio (1 M) en pequeñas cantidades (alrededor de 0.01 a 0.03 ml). Las soluciones tanto de ácido ortofosfórico como de hidróxido de sodio se encuentran muy diluidas, esto se aprecia a través de sus concentraciones molares, por lo tanto, no se consideró su participación en el equilibrio iónico y la disociación de las sales.
La masa total de cada punto experimental fue de 20 gramos, de la cual un 10 % en peso es extracto clarificado de b-ficoeritrina. Se denomina extracto clarificado al sobrenadante que resulta de la centrifugación del extracto crudo (Hernández-Mireles, 2006).
El extracto crudo de b-ficoeritrina se obtuvo de la disrupción celular de la microalga roja
Porphyridium cruentum que fue previamente cultivada durante 30 días en el medio descrito por Bermejo et al. (2002). La disrupción celular se llevó a cabo por sonicación de acuerdo al procedimiento reportado por Hernandez-Mireles (2006).
Los estudios de separación se llevaron a cabo en una probeta graduada de 500 ml y 2.6 cm. de diámetro interno. El intervalo entre cada línea de graduación fue de 0.2 cm.
Para cada punto experimental se mezcló su correspondiente % peso de PEG, sal, agua y extracto clarificado, se agitó la mezcla durante 10 minutos y se dejó reposar.
Durante el reposo se registró el tiempo en el que la línea inferior de cada fase llegaba a cada línea de graduación. Las mediciones se realizaron hasta observar que la relación de volumenes de fases Vr (volumen fase superior/volumen fase inferior) se mantenía constante.
Una vez observada la relación de volúmenes constante, se extrae una muestra de cada fase de 5 ml. para medir su densidad, viscosidad cinemática
v
rel y concentración deproteína total.
La densidad de fases se midió a temperatura ambiente (25 °C), a través del peso de 5 ml de muestra, las mediciones se realizaron por triplicado para su validación.
Para medir la densidad de la mezcla se utilizó el mismo procedimiento para medir la densidad de cada fase, sólo que la muestra a analizar se tomó posterior a la agitación del sistema.
Posteriormente, se determinó la viscosidad cinemática de las muestras a temperatura ambiente (25°C) utilizando un viscosímetro de Ostwald. Las mediciones se realizaron por triplicado para su validación. La viscosidad cinemática se calculó midiendo el tiempo de flujo de un volumen dado de líquido en un tubo capilar, bajo la influencia de la gravedad. Se calibró el equipo através de la determinación de la viscosidad cinética del agua. Para la conversión de la viscosidad cinemática a viscosidad absoluta,
, se utilizó la ecuación (3.14) presentada en el Capítulo 3. Para los cálculos de conversión, se utilizó la densidad experimental como la densidad requerida.Para estimar la concentración de la proteína total se utilizó el método de Bradford.
Para la determinación de la proteína en las muestras, se prepararon ensayos con 1.5 mL del reactivo de Bradford (Bradford reagent B69916, Sigma Chemicals USA) y 50 Lde la solución problema. La muestra se agitó por inversión y se dejó reposar por 10 minutos de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por el proveedor (Sigma Chemicals USA). Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado a temperatura ambiente (25 °C).
Los ensayos se leyeron a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro de luz ultravioleta-visible (Beckman DU650, Beckman Instruments USA). Para la determinación de la proteína total se realizó previamente una curva de calibración utilizando como proteína estándar albúmina bovina (BSA, B4287, Sigma Chemicasl USA) preparada en soluciones de concentración conocida (0.3-1.0 mg/mL).
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Todo el procedimiento anterior se realizó por duplicado con la finalidad de validar los resultados obtenidos. En la Tabla C.1 del Apéndice C se presenta un resumen de los resultados.
En el tiempo en el que el Vr del sistema se estabiliza, se considera que se alcanzó el equilibrio termodinámico. Para respaldar esta suposición, cada punto experimental fue sometido a centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm, en lugar de utilizar la separación por gravedad como se ilustra en la Figura 3.3 (a). Se siguió el mismo procedimiento de determinación de propiedades y concentración de proteína que se describió con anterioridad. Los resultados obtenidos que se muestran en la Tabla C.2 del Apéndice C, demuestran que hay mínimas variaciones entre las propiedades medidas en el tiempo en el que se observa Vr estable y las propiedades al equilibrio.
Figura 3.3 (a) Sistema de separación en fases acuosas por gravedad. (b) Sistema de separación de BPE en fases acuosas centrifugado.