Cocaceas gram (-) cocaceas gram + Bacilos gram (-) bacilos gram +
Morfología Bacteriana Morfología Bacteriana Agrupación Agrupación Afinidad Tintorial Afinidad Tintorial Especies Asociadas Especies Asociadas
MEDIOS DE CULTIVOS
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3
Para el aislamiento estudio y clasificación de los microorganismos es necesario mantenerlos en un medio en el que dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios además de su desarrollo, los microorganismos pueden manifestar sus características de crecimiento y sus propiedades bioquímicas, aspectos bien importantes para su clasificación.
Los medios de cultivos son soluciones en estado de gel, que poseen todas las sustancias que se requieren para el desarrollo de los microorganismos.
Estos medios son imprescindibles paran el laboratorio de microbiología, por lo que su buena preparación, mantención y control nos entregan confiabilidad en los resultados. Para que las bacterias se puedan desarrollar de forma adecuada en los medios, estos deben cumplir ciertas condiciones, es decir temperatura adecuada, Ph y deben ser estériles (libres de cualquier microorganismo).
Estos según sus componentes se dividen en:
o Agar nutritivos, agar selectivos, agar diferencial, agar enriquecidos.
o Existen medios de cultivos sintéticos o artificiales de composición química definida y medios naturales que se preparan en base a sustancias naturales. (Por Ej: agua Peptonada, caldo común, leche, etc.)
Según el estado físico se clasifican en: o Medios líquidos,
o Medios sólidos, o Medios semisólidos
Los medios de cultivos, según sus componentes pueden clasificarse en cuatro tipos:
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3
medios nutrientes o de soporte,
medios selectivos y
medios diferenciales
Medios de Enriquecimiento
Favorecen el sobrecreciendo de un determinado microrganismo a partir de una muestra que lo tiene en escasa cantidad, con predominio de la microbiota habitual.
Medios Nutrientes o de Soporte
Contienen nutrientes que permiten que la mayoría de los microorganismos no fastidiosos crezcan en la misma proporción en que se encuentran en la muestra, sin permitir que otro microorganismo crezca exageradamente (agar nutriente, agar cerebro corazón).
Medios Selectivos
Contiene uno o más agentes inhibitorios (antibiótico-colorantes) que inhiben a los microorganismos excepto al que se desea recuperar (Fenil-Etil-Alcohol).
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3
Medios Diferenciales
Emplean metabolitos que permiten a los microorganismos expresar características metabólicas o de cultivo que hacen posible distinguirlos de otros con características diferentes (Ej: el agar sangre cordero permite el crecimiento y diferenciación según tipo de hemólisis y/o producción de pigmento)
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Mantención de los Medios de Cultivos
Los medios de cultivos deshidratados deben mantenerse en un lugar seco y oscuro, a una temperatura aproximadamente de 15ºC a 25ºC, en frascos bien cerrados para evitar la entrada de humedad, ya que la absorción de agua lleva a una alteración del Ph y eventualmente a formación de precipitados.
Bajo condiciones ideales, los medios de cultivos deshidratados, en sus frascos originales sellados, pueden ser mantenidos al menos hasta 5 años sin deteriorarse.
Preparación del medio de cultivo deshidratado:
Se debe usar agua destilada con pH lo más cercano posible a 7,0. Los receptáculos destinados para usar deben ser absolutamente limpios y lo suficientemente grande para poder mezclar el medio de cultivo con facilidad. En lo posible, no se debe prepara más de 1-2 litros por recipiente.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3
El medio de cultivo se debe pesar según los ml a preparar y según indicación del fabricante. A este ya pesado se le añade aproximadamente la mitad del agua necesaria para su reconstitución y se mezcla hasta conseguir una suspensión homogénea.
Después se incorpora la cantidad restante del agua.
Luego de esto se llevan al autoclave para su posterior esterilización (se debe tener en cuenta que hay medios de cultivos que no se esterilizan)
Los medios de cultivos que no contienen ni agar ni gelatina, se pueden disolver en general en agua fría o con un ligero calentamiento.
Los medios nutritivos que contiene agar o gelatina, deben ser calentados al baño María hasta conseguir su disolución. Debe evitarse el calor excesivo. En los medios de cultivos que no necesitan ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible lograr su completa disolución.
Ajuste del pH:
El valor del pH depende mucho de la composición del medio de cultivo, de su temperatura y del tratamiento al que ha sido sometido (disolución, esterilización)
Debido a que los microorganismos encontrados en muestras clínicas crecen mejor a un pH cercano al pH neutro, es esencial controlarlo en forma regular después de autoclavar. En los medios de cultivos sólidos, la medición del pH se realiza a 45-50ºC (medios liquido aun) y en los medios nutritivos líquidos se hace a temperatura ambiente.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Esterilización de los Medios de Cultivos:
Esta puede realizarse en un autoclave o por filtración. Volúmenes de hasta 500ml de la mayoría de los medios son autoclavados a 121ºC por 15 minutos. Volúmenes más grandes pueden necesitar de 20-30 minutos o más. Deberían usarse temperaturas de 116-118º C para medios conteniendo carbohidratos termoestables. Los carbohidratos termolábiles, deberían ser esterilizados por filtración y agregarse al medio ya autoclavado y enfriado, en forma aséptica.
Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se hace en autoclave a 121ºc durante 15 minutos.
Los medios de cultivo deben sacarse de inmediato del autoclave y enfriarlos rápidamente.
Vertido del Medio de Cultivo en Placas:
Para evitar la formación de gotitas de agua de condensación en la tapa de las placas, se debe verter en ella el medio de cultivo a una temperatura de 45-55º C. Previamente hay que mezclar bien el medio de cultivo. La repartición debe ser hecha cuidadosamente para evitar la formación de burbujas. Si estas se producen, se puede pasar la llama del mechero sobre la superficie del agar antes de que este se solidifique.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Tubos de Agar Inclinado:
Los tubos llenos con medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada, de tal manera que quede una parte cilíndrica de aproximadamente 3 cm y otra parte en pico de flauta de igual dimensión.
Control de Calidad de los Medios de Cultivo:
Cada vez que se preparan medios de cultivo de un nuevo lote o de un nuevo frasco, deben efectuarse cultivos de control que aseguren su esterilidad, un pH adecuado y reacciones bioquímicas correspondientes a los controles de calidad establecidos.
En aquellos medios en que se agregan materiales después de la esterilización (por ejemplo agar Thayer Martin, Agar Chocolate, Agar Campylobacter) en cada preparación deberá realizarse control de calidad, sembrando los microorganismos sugeridos para el control de cada medio.
Para controlar las esterilidad de las placas preparadas, incubar el 1% de las placas a 36º C durante la noche (luego de esto, estas se deben eliminar). El control de calidad debería ser visual y por subcultivo. Si se observa consistentemente que no hay contaminación, este control de esterilidad puede discontinuarse. Deberá reiniciarse el control cada vez que se vuelva a observar contaminación y hasta que el problema se haya resuelto.
Cada tubo, placa o reactivo preparado, debe tener una etiqueta que indique la fecha de preparación.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3
Conservación de Medios de Cultivos Preparados, listos para su uso
Los medios de cultivos preparados tienen un tiempo limitado de conservación; cuando no se indica otra cosa y bajo condiciones adecuadas, éste es de varios meses.
Los medios que no contienen suplementos ni enriquecimientos son estables hasta por un año si se conservan en tubos con tapa rosca. Estos mismos medios en placa pueden mantenerse hasta por 6 meses. Los medios como Agar Sangre, Agar Chocolate y Thayer Martin se consideran estables hasta por 3 meses. Se recomienda su almacenamiento a 4- 12ºC, cuando van a mantenerse por periodos de tiempos prolongados. No deben guardarse a temperatura por debajo a 0ºC.
Es posible su conservación durante 1 semana a temperatura ambiente y siempre que estén protegidos de la luz.
Las placas pueden ser refrigeradas durante una semana sin deteriorarse, pero deberían envolverse en bolsas de plásticos o papel para minimizar la perdida de agua.
Por otro lado, luego de utilizar estos medios con cultivos bacterianos, se deberá efectuar la esterilización en autoclave (73º C por 12-15 minutos), antes de ser eliminados.
Agar Sangre
El agar sangre de cordero al 5% es el medio de cultivo más comúnmente usado para el aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas no fastidiosas.
Por su contenido en nutrientes, permite el buen desarrollo de las bacterias. Por otra parte, es posible realizar una identificación primaria de las bacterias por las características morfológicas de las colonias en el agar sangre.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Agar Chocolate
Es un medio de cultivo usado para el aislamiento primario de la mayoría de las bacterias aeróbicas incluyendo además a algunos fastidiosos (Haemophilus, Gardnerella,
Neisseria).
El agar chocolate es preparado agregando sangre de cordero a un medio de agar base enriquecido, el que está a una alta temperatura (aprox. 80º C) para lisar los glóbulos rojos y liberar los factores X y V, lo que lleva a mejorar el desarrollo de las bacterias y permite además el aislamiento de Haemophilus.
Agar Mac Conkey
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial más usado para inhibir microorganismos gram positivos. Permite la selección y recuperación de las Enterobacterias y bacilos gram negativos entéricos relacionados.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias gram positivas y de algunas bacterias gram negativas fastidiosas. El indicador de pH, rojo neutro, da las características diferenciales. La lactosa es el único carbohidrato presente en el medio.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Agar Salmonella-Shigella (SS)
Es uh medio selectivo usado para el aislamiento de Salmonella y Shigella, inhibiendo el desarrollo de bacterias coliformes.
Agar TCBS
Medio selectivo para recuperar cepas de Vibrio a partir de muestras clínicas.
Las altas concentraciones de tiosulfato y citrato férrico, junto con la fuerte alcalinidad del medio inhiben el crecimiento de las Enterobacterias, haciendo de este un medio selectivo para el desarrollo de Vibrio.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3 Caldo Selenito
Es recomendable para el aislamiento de Salmonella, de muestras tales como: deposiciones, orina o aguas sucias que tiene altas concentraciones de bacterias mixtas.
Agar Thayer Martin
Este medio es recomendado para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae de todos aquellos sitios que podrían tener microbiota mixta, y de Neisseria meningitidis de muestras nasales y bucofaríngeas.
Es un medio enriquecido que contiene 3 antibióticos y un antifúngico, los que actúan como agentes selectivos para la inhibición de la microbiota.
Asignatura: “Microbiología Aplicada al Laboratorio” TLC – 119 Plan 3