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Determinación de la Concentración Inhibitoria Fraccionada de C albicans frente a la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora

D. Evaluación de la asociación del AECC con fluconazol mediante el método de “tablero de ajedrez”

4. Determinación de la Concentración Inhibitoria Fraccionada de C albicans frente a la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora

y Fluconazol mediante el método de “tablero de ajedrez” (Anexos N°23,24)

Tabla N° 3. Concentración Inhibitoria fraccionada del AECC y Fluconazol sobre

Candida albicans obtenidos mediante el método de “Tablero de ajedrez”

CIFAECC CIFFCZ ∑CIF

0.098 0.385 0.483 0.085 0.364 0.449 0.067 0.373 0.440 0.059 0.379 0.438 0.100 0.353 0.453 0.091 0.350 0.441 0.073 0.364 0.436 0.062 0.358 0.420 0.119 0.327 0.446 0.102 0.308 0.410 0.077 0.300 0.377 0.060 0.274 0.334 0.119 0.244 0.362 0.100 0.224 0.324 0.075 0.218 0.293 0.053 0.179 0.232

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IV. DISCUSIÓN

Mediante los ensayos in vitro para evaluar la susceptibilidad de las cepas de C. albicans frente a las distintas concentraciones del aceite esencial de Corymbia citriodora se encontró que las cepas fueron sensibles a las cuatro concentraciones trabajadas (25%, 50%, 75% y 100%). Se presentó una actividad antimicótica sumamente sensible en las concentraciones al 75% (642,7 mg/mL) y 100% (857 mg/mL) ya que los halos de inhibición promedio fueron de 23,20 mm y 42,30 mm respectivamente. Resultados que concuerdan con los de Musyimi et al. (42) quienes afirman que el aceite esencial de Corymbia citriodora es extremadamente efectivo al 100% debido a que muestra una completa inhibición de crecimiento con esta concentración.

Las zonas de inhibición de crecimiento encontradas fueron evidentemente mayores a las encontradas por Luqman et al. (38) quienes trabajaron con cepas de C. albicans salvajes y cepas mutantes resistentes a fármacos, encontrado que el aceite esencial de Corymbia citriodora posee mayor actividad antifúngica en este último grupo; sin embargo, la zona de crecimiento inhibitorio para ambos grupos de cepas no superó los 15 mm.

La actividad antimicótica del AECC se debe a los fitoconstituyentes que posee, se considera que sus principales monoterpenos son citronelal (60-69%), citronelol (10-12%), isopulegol (4-8%)(37,52). El mecanismo de acción del AECC no se ha estudiado en detalle debido a la presencia de diferentes grupos de constituyentes/compuestos, pero se considera que la acción puede deberse a cualquiera de los siguientes mecanismos: daño o degradación de la pared celular, alteraciones en la membrana citoplasmática, agotamiento de la fuerza motriz de

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protones, flujo de electrones, fuga de contenido celular, daño a las proteínas de membrana y transporte activo, coagulación del contenido celular (38).

Por otro lado, al evaluar la susceptibilidad de las cepas frente a Fluconazol se halló una actividad nula y se determinó un halo de inhibición de 6 mm en todas las repeticiones realizadas por lo que se las consideró como cepas resistentes a Fluconazol. Existen múltiples mecanismos de resistencia a los azoles en especies de Candida (53) dentro de los cuales se describen: describen alteraciones de las enzimas relacionadas en la síntesis de ergosterol y la disminución de la concentración de drogas debido al desarrollo de bombas de eflujo activas que producen una disminución de las concentraciones de fármaco en el sitio de acción. Estas bombas están codificadas por los genes CDR (confiere resistencia a casi todos los azoles) y MDR (espectro más estrecho específico para fluconazol) (54).

Se determinó que la concentración mínima inhibitoria del AECC fue de 214,25 mg/mL (concentración del AECC al 25%) con un conteo de UFC de cero a partir de esta concentración. Los resultados obtenidos contrastan con los de otros autores, siendo este resultado mucho mayor que el encontrado por Barbosa et al.(41) quienes determinaron un CMI de 0,25 mg/mL y lo obtenido por Luqman et al.(38) cuyos resultados de CMI varían desde 1,25mg/mL a 5mg/mL con cepas resistentes y 2,5 mg/mL a 5 mg/mL con cepas salvajes.

La disparidad de resultados puede ser atribuida a la variación de la composición química del aceite esencial, puesto que los aceites esenciales están constituidos por diferentes constituyentes bioquímicos. Estos componentes también pueden variar de acuerdo al tipo de hojas utilizadas para la extracción del aceite, tal como

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lo afirman Batish et al.(40) quienes encontraron diferencias en la composición de monoterpenos y demás fitoconstituyentes en hojas jóvenes, adultas, senescentes y hojarasca. En el presente estudio se utilizaron los tipos de hojas jóvenes y adultas, que según reporta Batish et al. (40) presentan una mayor cantidad de constituyentes sobre todo de citronelal, citronelol e isopulegol. Así también la diferencia de resultados podría explicarse por las variaciones regionales en cuanto a condiciones climáticas, localización geográfica y los tipos de cepas utilizadas.

Al evaluar la asociación del AECC y Fluconazol por el método de difusión en disco se determinó que el 100% de los cultivos realizados mostraron sinergismo ya que el aumento de los halos de inhibición fue evidente y a medida que se incrementa la concentración del AECC se incrementa también el diámetro del halo de inhibición de ambos tratamientos sin mostrar antagonismo. Esto evidencia que los efectos antifúngicos de ambos tratamientos se potencian resultando en una amplia acción sinérgica.

Los resultados obtenidos concuerdan con el análisis realizado de la asociación de ambos tratamientos mediante el método del “tablero de ajedrez” en el cual se determinó que la concentración inhibitoria fraccionada para cada una de las combinaciones realizadas se encuentra en un rango menor a 0,5 (0,232-0,483) lo que sugiere de igual modo la presencia de sinergismo. Se demostró también que el efecto sinérgico de la combinación de AECC y Fluconazol tiene una gran eficacia para revertir la resistencia de C. albicans in vitro puesto que mejora el efecto antifúngico del Fluconazol al reducir su CMI de 64ug (CMI para cepas resistentes) a 8 ug (CMI para cepas sensibles).

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El sinergismo observado puede explicarse por los monoterpenos propios de la especie trabajada, Xu et al. (55) reportaron que estos inhiben competitivamente la excreción de fluconazol puesto que regulan de forma consistente la expresión de genes de la bomba de eflujo en diferentes cepas de C. albicans al generar una alteración en la expresión de genes CDR involucrados en la resistencia a fluconazol. Por otro lado, el modo de acción propuesto por el citronelal es una alteración de la homeostasis de la membrana asociada con una disminución del contenido de ergosterol (56) lo cual también contribuiría al singergismo propuesto y coincide con la propuesta de Batista et al. (57) quienes afirman que el citronelal es un compuesto prometedor para combatir enfermedades causadas por hongos del género Candida.

También se plantea que el AECC es biológicamente activo contra los biofilms en formación y maduros de C. albicans al disminuir la actividad metabólica en ambos biofilms, actuando sobre la morfología y estructura de estos promoviendo la disminución de hifas.(58)

El AECC se perfila como una probable fuente de medicamentos antimicóticos que en combinación sinérgica con medicamentos convencionales como el Fluconazol puede disminuir las concentraciones de este en un intento por evitar los efectos secundarios y el aumento de la resistencia. El presente estudio in vitro demuestra sinergismo entre el AECC y Fluconazol, resultado que justifica estudios más extensos en el intento de evaluar el potencial antifúngico del AECC tanto in vitro como in vivo.

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V. CONCLUSIONES

 El aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol tiene efecto sinérgico contra Candida albicans.

 La susceptibilidad de Candida albicans frente al AECC fue de 13,1 mm, 18,5 mm, 23,2 mm, 42,3mm al 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente mediante la técnica de Kirby Bauer.

 La susceptibilidad de Candida albicans frente al Fluconazol fue de 6mm mediante la técnica de Kirby Bauer.

 La concentración mínima inhibitoria del AECC contra Candida albicans

fue de 214,25 mg/mL mediante la técnica de macrodilución.

 La susceptibilidad de Candida albicans frente a la asociación de AECC al 25%, 50%, 75% y 100% y Fluconazol fue de 24,6 mm, 46,8 mm, 53 mm y 68 mm respectivamente mediante el método de difusión en discos.  La concentración inhibitoria fraccionaria del aceite esencial de Corymbia

citriodora y Fluconazol contra Candida albicans fue menor de 0,5 en todas las combinaciones realizadas mediante la técnica de “tablero de ajedrez”.

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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