Determinación de la actividad bactericida

En esta etapa se realizaron las pruebas cualitativas y cuantitativas para la selección de la formulación o formulaciones más efectivas evaluándolas con los microorganismos indicadores Escherichia coli y Staphylococcus aureus, las cuales fueron donadas por el Laboratorio de Calidad de Aguas de la Administración Nacional de Acueductos y Alcantarillados (ANDA) ya que estas poseen la certificación de la American Type Culture Collection (ATCC) (ver anexo 8).

3.3.1 Pruebas de Ausencia-Presencia

En esta prueba se realizó la metodología expuesta en el anexo 2, para lo cual fue necesario el escalamiento de los microorganismos con el objetivo de tener un cultivo de 48 horas en cantidad abundante ya que se necesitó contaminar un gran número de palillos, previamente esterilizados, por las características del procedimiento debido a que se realizaron en total 60 pruebas, 30 para Staphylococcus aureus y 30 para Escherichia coli de las cuales comprenden las 15 formulaciones a testear y sus respectivos duplicados.

1. Escalar las cepas de E. coli y S. Aureus durante 48 horas.

Ilustración 3.6 Flujograma del proceso experimental de la prueba Ausencia-Presencia de

microorganismos expuestos al desinfectante basado en aceite esencial de Eucalipto.

1.Escalar las cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus durante 48 horas.

2.Preparar 400 ml de CTS, esterelizar el mismo junto con 61 tubos de ensayo, 60 palillos y 15 pipetas y 3 probetas.

3.Rotular los tubos indicando el numero de formulación y el microorganismo que se probara, vertir 5ml de caldo en cada tubo.

4.Introducir dos palillos durante 1 minutos en el cultivo S. Aureus, trasladar los palillos a la formulación 1 y dejar durante una hora.

5.Retirar los palillos de la formulación, sembrar cada uno mediante repique en tubo conteniendo CTS.

6.Repetir los pasos 4 y 5 para la formulacion 1, con E. coli

7. Repetir pasos 4, 5 y 6 para las 14 formulaciones restantes.

8. Reservar un tubo únicamente con caldo para que sea el blanco de comparación.

9. Incubar durante 48 h a 37°C, observar los resultados comparando con los estandares de turbidez mcfarland y registrar los datos.

Se preparó toda la cristalería a usar, esterilizándose en autoclave; Se preparó 400 ml de medio de cultivo Caldo Tripticasa Soya (CTS) dispensándose 6 ml en cada uno de los 60 tubos para luego ser esterilizados como se muestra en la ilustración 3.7 y 3.8.

Ilustración 3.7 Llenado de los tubos con medio CTS. Ilustración 3.8 Tubos llenos con CTS.

Se dispensaron 5 ml de desinfectante en 60 tubos esterilizados y debidamente rotulados para cada tipo de microorganismo y formulación para estar listos al momento de pasar el minuto de la contaminación de los palillos como se muestran en la ilustración 3.9.

Ilustración 3.9 Formulaciones listas para ser dispensadas en los tubos de ensayo.

Los palillos fueron contaminados por un periodo de 1 minuto con las cepas ya escaladas, después del cual fueron expuestos a las formulaciones por 1 hora, como se muestra en la

ilustración 3.10, posteriormente se inocularon los tubos conteniendo CTS con los palillos recién salidos de las formulaciones de desinfectante para ser puestos a incubar por 48 horas a una temperatura de 37 oC.

Ilustración 3.10 Formulaciones conteniendo a los palillos contaminados con S. aureus y E. coli 3.3.2 Prueba de tiempo de contacto

De la prueba anterior se obtuvieron dos formulaciones que presentaron los mejores resultados (Concentración 4% v/v, pH=5 y Concentración 5% v/v, pH=5); por lo que estas se consideraron con la mayor actividad bactericida y por lo tanto se sometieron a la prueba de tiempo de contacto por el método de dilución en tubo metodología expuesta en el anexo 4. Para lo cual fue necesario realizar nuevamente el escalamiento de los microorganismos con el objetivo de tener un cultivo de 48 horas.

1. Escalar las cepas de E. coli y S. Aureus durante 48 horas.

Ilustración 3.11 Flujograma de proceso para prueba de tiempo de contacto de

microorganismos contra el desinfectante basado en aceite esencial de Eucalipto.

1.Escalar las cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus durante 48 horas.

2. Preparar 200 ml de CTS, esterelizar el mismo junto con 36 tubos de ensayo, y 16 pipetas y 2 probeta.

3. Rotular los tubos indicando el numero de formulación y el microorganismo, el tiempo de contacto que se estudiará, vertir 5ml de

caldo en 16 tubos.

4. Tomar 1 ml de la cultivo de S. aureus y añadir a un tubo vacío, posteriormente agregar 1 ml de la formulación 8, este sera el tubo de

mezcla.

5. Esperar 30 segundos, y trasladar 1ml de del tubo de mezcla a un tubo con caldo CTS, incubar por 48h.

6. Repetir pasos 4 y 5 esperando 5, 15 y 30 minutos.

7. Repetir pasos 4, 5 y 6 para E. coli.

8. Repetir pasos 4, 5, 6 y 7 para la formulación 15.

9. Incubar durante 48 h a 37°C, observar los resultados comparando con los estandares de turbidez mcfarland y registrar

Se prepararon 200 ml de medio de cultivo CTS para llenar 18 tubos. Se tomó 1 ml de la cepa cultivada y se añadió a un tubo vacío para posteriormente agregar 1 ml de desinfectante ver ilustración 3.12, se agitó y se dejó pasar los tiempos de estudio después de los cuales se tomó una alícuota de 0.5 ml de esta mezcla para inocular los tubos conteniendo CTS debidamente identificados, poniéndose a incubar por 48 horas a 37oC. Lo anterior se realizó para cada uno de los microorganismos.

Ilustración 3.12 Exposición de la cepa al desinfectante formulado. 3.3.3 Prueba Cuantitativa de la actividad bactericida

De la prueba 3.3.1 se obtuvieron dos formulaciones que presentaron los mejores resultados por lo que estas se consideraron con la mayor actividad bactericida y por lo cual estas fueron enviadas al laboratorio del Centro de Investigación y Desarrollo en Salud (CENSALUD) de la Universidad de El Salvador (UES) en donde se sometieron a la prueba de Evaluación de Actividad Antimicrobiana basada en el manual “Official Methods of Analysis “AOAC.