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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS

Técnica de césped

2.3 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS

Se utilizaron dos métodos para determinar la concentración de microorganismos por mililitro durante el proceso de fermentación: métodos directos como recuento en cámara de conteo de Neubauer y técnica del Número Más Probable y densidad óptica como método indirecto.

2.3.1 Conteo en Cámara de Neubauer

Es un método directo, en el cual se determina bajo el microscopio el número de microorganismos totales (vivos y muertos). Se recomienda utilizar este método en muestras con concentraciones de microorganismos mayores o iguales a 106 bacterias/ml y que no contengan partículas que impidan determinar el número de los microorganismos. Si la población de microorganismos en la suspensión es muy alta se debe diluir.

2.3.1.1 Equipos y materiales

La cámara de Neubauer esta formada por un cuadro central dividido en 25 cuadros grandes con aristas de 0.2 mm, cada cuadro grande esta dividido por 16 cuadros pequeños con aristas de 0.05mm y la profundidad de la cámara es de 0.1mm.

Microscopio de luz Cubre objetos Porta objetos Gotero

Tubos de ensayo

Pipetas de 0.1ml (± 0,001 ml), 1ml (± 0,01 ml) y 5ml (± 0,045 ml)

2.3.1.2 Medios, reactivos y cultivos Cultivo de BAL

Caldo MRS

2.3.1.3 Metodología

Extraer 1 ml de la muestra en un tubo de ensayo.

Realizar la dilución seriada de la muestra hasta obtener aproximadamente 106 microorganismos por mililitro.

Colocar una gota de la muestra en la cámara de Neubauer y observar al microscopio. Aumento 40 X.

Contar el número de microorganismos/ ml. Si la muestra obtenida para el conteo no es totalmente homogénea, es necesario contar los microorganismos observados en 10 cuadros grandes, si la muestra es homogénea contar los microorganismos contenidos en 5 cuadros grandes y calcular el promedio de microorganismos en cada cuadro. Para conocer el número de microorganismos por mililitro (NMO / ml), se realiza la siguiente operación:

XX

NMO =

(dX * VN) Donde:

XX = Promedio del número de microorganismos contados en los cuadros pequeños de la cámara Neubauer.

dX =Factor de dilución de la muestra.

VN = Volumen de un cuadro pequeño de la cámara Neubauer en mililitros.

Calcular la desviación estándar y elaborar la curva de crecimiento (concentración de microorganismos por mililitro en función del tiempo) utilizando como rango una vez la desviación para obtener confiabilidad del 95%.

Calcular tasas de crecimiento y tiempos de generación para las fases analizadas.

2.3.2 Número Más Probable

Es un método directo, en el cual se efectúan determinaciones de conteo de viabilidad empleando sólo cultivos o muestras líquidas. En ésta técnica, la muestra que va a ser cuantificada se diluye hasta que la densidad celular sea menor 1 microorganismo /ml.

En éstas condiciones ya no es apropiado hablar de concentración de células, sino más bien de la probabilidad de encontrar una célula.

Esta probabilidad puede convertirse nuevamente a concentración celular en la muestra no diluida, considerando el número de diluciones y el empleo de la tabla del NMP. Esta tabla es una derivación estadística del número esperado o más probable de células que producirá el patrón de crecimiento observado. Para que llegue a ser útil el procedimiento de NMP, la muestra debe diluirse lo suficiente; si no se hace esto, todas las muestras contendrán células viables y todos los tubos inoculados mostrarán crecimiento.

Se han hecho tablas estadísticas para ser empleadas con inoculaciones de 3, 5 y 10 réplicas de tubos de crecimiento. Cuanto mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor será la precisión obtenida. Para realizar la curva de crecimiento de las BAL con esta técnica, se emplearon 3 réplicas.

2.3.2.1 Equipos y materiales

Tubos de ensayo Caldo MRS

Pipetas de 1 ml (± 0,01 ml) Gradillas

Incubadora Mechero

Cámara de flujo laminar

2.3.2.2 Medios, reactivos y cultivos Cultivo de BAL BIOFLORA ABY Caldo MRS

2.3.2.3 Metodología

Para conocer la concentración en la cual no hay crecimiento de las BAL, se realizaron diluciones seriadas por triplicado para el cultivo fermentado durante 40h.

Para la primera dilución (10-1) se tomaron 0.5 ml del cultivo y se diluyeron en un tubo de ensayo con 4.5 ml de caldo MRS, a partir de esta dilución se realizaron diluciones seriadas con las mismas cantidades hasta 10-12. Se incubaron a 41°C durante 24 horas y se observó que no hay crecimiento cuando la dilución llega a 10-9. Una vez conocida esta concentración mínima se realiza el siguiente procedimiento.

Tomar 0.5 ml del cultivo de BAL e inocular en un tubo que contiene 4.5 ml de caldo MRS, donde la dilución es 10-1.

Tomar del primer tubo 0.5 ml e inocular en el siguiente tubo que contiene 4.5 ml de caldo MRS y así sucesivamente hasta llegar a una dilución de 10-9.

Inocular 1 ml de cada dilución en tres tubos que contengan 5 ml de caldo MRS.

Incubar durante 24 horas a 41 °C.

Determinar la concentración de microorganismos por mililitro empleando la tabla para determinar el número más probable diluciones 1:10, para 3 tubos en paralelo.

Realizar la curva de crecimiento.

Calcular tasas de crecimiento y tiempos de generación para las fases analizadas.

2.3.3 Técnicas turbidimétricas

Las técnicas turbidimétricas son métodos indirectos que se utilizan para determinar la concentración de microorganismos por unidad de volumen o densidad, en los cuales los cultivos de microorganismos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidometría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. La nefelometría mide la luz difractada. Por medio de éstos procedimientos se puede estimar el número de microorganismos en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión microbiana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. La relación entre luz transmitida y difractada depende de la concentración, tamaño, forma e índice de difracción de partículas de la longitud de onda y recorrido de la luz. Las partículas interiores también influyen en ésta medida. Dependiendo del tamaño y características ópticas de los microorganismos existe una concentración mínima. El espectrofotómetro, es el aparato que se utiliza para medir la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión microbiana es medida por una celda fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de microbios. Normalmente el crecimiento microbiano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (densidad óptica), ya que ésta última es directamente proporcional al número de microorganismos presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia y la densidad óptica se expresa matemáticamente de la siguiente manera:

Densidad óptica = 2 - log % de transmitancia.

La lectura se realiza de la densidad óptica cada hora durante toda la fermentación y se elabora la gráfica de densidad óptica en función del tiempo.

2.3.3.1 Equipos y materiales

1 Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible (Figura 13) 2 Cubetas porta muestras

18 Pipetas de 10 ml (± 0,075 ml) 5 Pipetas de 1 ml (± 0,01 ml) 1 Gradilla

1 Frasco lavador

2.3.3.2 Medios y reactivos

Agua de peptona Caldo MRS Agua destilada

2.3.3.3 Metodología

§ Conectar el espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible.

§ Con las cubetas del espectofotómetro deben tenerse en cuenta las siguientes precauciones:

- Limpiar y secar las celdas antes de introducirlas en el instrumento.

- Coger las celdas por la parte superior y lavarlas con agua destilada en abundancia.

• Realizar el espectro de absorción del caldo MRS entre 200 y 900 nm, para determinar la longitud de onda en la cual los valores obtenidos correspondan únicamente al crecimiento de las BAL.

• Introducir en una celda el blanco (agua destilada) y en la otra la muestra.

• Realizar la lectura cada hora.

Figura 13. Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible.

• Elaborar la gráfica de densidad óptica en función del tiempo.