Diferències en el Mecanisme catalític entre classes de RNR

In document Estudi de l'expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d'Escherichia coli (página 39-42)

Les tres classes de RNR presenten una estructura molt similar quant a la composició del centre actiu: totes tres conserven la cisteïna encarregada de generar el radical tiil per dur a terme la reducció dels diferents ribonucleòtids. Aquesta cisteïna

correspon a la Cys439 en la RNR de classe Ia d’E. coli, a la Cys408 de la RNR de

classe II de L. leichmanni i la Cys290 en la RNR de classe III del bacteriòfag T4. Apart d’aquesta similitud, les tres classes de RNR es diferencien en diferents aspectes sobretot en el mecanisme d’iniciació de la catàlisi.

3.1.4.2.1 Mecanisme catalític de la RNR de classe Ia

El mecanisme de catàlisi de la RNR de classe Ia és el descrit en l’apartat 3.1.4 i és el més estudiat. En la RNR de classe Ia, el radical es genera en la proteïna NrdB (R2) mentre que la catàlisi (reducció del ribonucleòtid) es dóna en la proteïna NrdA (R1), sent les dues proteïnes essencials per a l’activitat de l’enzim (3, 28).

Com ja s’ha comentat anteriorment, la subunitat R1 conté el centre catalític de l’enzim mentre que la R2 conté un radical tirosil i és capaç de generar un radical tiil al final d’una cadena d’electrons. Al final d’aquesta cadena d’electrons és on hi han dues cisteïnes conservades que configuren el centre actiu de l’enzim, en subunitat R1. En la RNR de classe Ia, la presència de l’oxigen és el que fa generar un centre di-fèrric FeIII- O-FeIII i un radical proteic en la Tyr122 encarregada de transferir el radical a la cisteïna Cys439, la qual iniciarà la reducció del substrat (60, 61).

La RNR de classe Ia conté residus aminoacídics actius en el centre actiu de l’enzim que es troben estructuralment més conservats amb la classe II que no amb la classe III. Els aminoàcids Glu441, Asn437, Cys225 i Cys462 de la classe Ia d’E. coli, corresponen als residus Glu410, Asn406, Cys119 i Cys419 de la RNR de classe II de

L. leichmannii (model bacterià per la RNR de classe II) (56).

El poder reductor necessari per tornar a reduir les cisteïnes i que es doni un altre cicle de reducció del ribonucleòtid ve donat pel sistema de tioredoxines o glutaredoxines juntament amb el NADPH (56). A més a més, estudis de cinètica i mutagènesis in vitro mostren un rol clau del parell de cisteïnes (CXXXXC o CXXC) en posició C-terminal de la subunitat R1 en la regeneració del poder reductor del seu centre actiu (62).

3.1.4.2.2 Mecanisme catalític classe Ib

La presència de les dues proteïnes addicionals NrdI i NrdH involucrades en la reducció de la ribosa són el tret diferencial de la RNR de classe Ib.

La flavodoxina NrdI es va identificar per primera vegada en E. coli i S. typhimurium per transcriure’s en el mateix operó que els gens nrdEF (63). NrdI posseeix unes condicions redox que li confereixen la capacitat de poder transferir dos electrons simultàniament, sent així, una excepció dins de la família de flavodoxines a

on l’usual és la transferència d’un sol electró (64). Estudis han demostrat que quan el cofactor del centre metàl·lic és el FeIII, NrdI només és capaç de proveir d’un electró mentre que quan és el MnIII en dona dos (65).

En resum, NrdI és l’encarregada de la biosíntesi del clúster de di-manganés en la proteïna NrdF. Quan aquesta proteïna està en forma reduïda (NrdIhq) s’encarrega de

reduir l’O2 a H2O2 o HO2 [HOO(H)], el qual està unit en el centre metàl·lic de NrdF,

proveint així l’oxidant necessari per la generació del centre de di-manganés (66). Després d’aquesta reacció, NrdI passa a estar en forma oxidada (NrdIox), en aquest

estat redox, NrdI es dissociaria de NrdF per permetre que la unió d’una altre NrdIhq o

bé, seria reduïda per un reductant desconegut (65).

Com s’ha dit al començament d’aquest apartat, la RNR de classe Ib també es diferencia de les altres classes per codificar per la seva pròpia glutaredoxina: NrdH. Aquesta glutaredoxina-like es va aïllar inicialment en Lactococcus lactis i després es va veure que tant E. coli com S. typhimurium presentaven homòlegs d’aquesta proteïna. NrdH posseeix el domini CXXC típic de les redoxines i és imprescindible perquè NrdI sigui activa i es pugui generar el radical (11). Una vegada general el radical, el mecanisme de transferència d’electrons és el mateix que per la RNR de classe Ia. En l’apartat 3.1.5.2 s’aprofundeix en l’estructura de NrdH i les diferències i semblances amb les tioredoxines i glutaredoxines.

Inicialment, estudis en el bacteri Corynebacterium ammoniagenes mostraven que la presència del radical tirosil requeria de la presència d’un centre di-fèrric, encara que la seva proteïna NrdF (corresponent a R2) podia tenir altres tipus de centres metàl·lics. Experiments a on es feia una tractament d’apoNrdF amb quantitats equimolars de ferro i manganés, resultaven en que la proteïna era capaç d’unir la mateixa proporció de cada cofactor (67). Anys més tard, i basant-se en estudis fets en

C. ammoniagenes (68) i Bacillus subtilis (69) a on es demostrava el requeriment del manganés pel seu creixement, es van fer diferents estudis in vitro on l’objectiu era aconseguir una proteïna NrdF activa i capaç de generar el radical tirosil. La purificació de la proteïna NrdF de C. ammoniagenes va establir que es requerís d’un centre de MnIII-O-MnIII per poder generar el radical (66, 70). Tot i així, NrdF és catalíticament actiu tant amb un centre di-fèrric com de di-manganés tot i que estudis in vivo

3.1.4.2.3 Mecanisme catalític classe Ic

Aquesta classe de RNR es va descobrir en Chlamydia trachomatis (8) sent aquest el bacteri a on més estudis s’han fet i en el que em basaré per explicar aquest apartat.

La gran diferència de la RNR classe Ic quant al mecanisme catalític és que genera un radical de fenilalanina, en comptes de tirosil, en un centre metàl·lic MnIV-O- FeIII en la subunitat NrdB. La cristal·lització de la proteïna NrdB de C. trachomatis va mostrar la posició d’una Phe127a on en la RNR de classe Ia hi ha una tirosina (8, 71).

Quan no hi ha O2, aquest centre es troba en estat MnII-FeII. En presència d’O2,

el MnII-FeII passa a un estat intermedi MnIV-FeIV i finalment a MnIV-O-FeIII (72). Altres estudis han demostrat que apart de l’O2, l’H2O2 també es capaç d’activar el

centre metàl·lic i generar el radical(14). Aquesta reacció es dona en dos passos a través del Trp51 (corresponent al Trp48 en E. coli) en comptes de la Tyr222 (equivalent a la Tyr338 d’E. coli) (73). Per analogia amb la RNR de classe Ia d’E. coli, la Cys672 conservada en la subunitat NrdA seria l’encarregada de reduir de manera reversible el MnIV a través de la cadena d’electrons generada pels residus aromàtics Tyr990 i Tyr991 en NrdA i Tyr338 i Trp51 en NrdB (74).

In document Estudi de l'expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d'Escherichia coli (página 39-42)