El método analítico de valoración de Cetirizina diclorhidrato por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en solución oral gotas no se encuentra en ninguna farmacopea oficial, por lo tanto es necesario demostrar mediante evidencia objetiva que el método puede cumplir con las características de desempeño y ser adecuado para su fin analítico.
En la Tabla 1 se muestran los resultados del parámetro Especificidad, donde se buscó identificar el principio activo en presencia del resto de componentes (matriz). La respuesta del estándar referente de Cetirizina diclorhidrato se evidenció en un pico gaussiano con tiempo de retención de 12.11 minutos y 14308251 unidades de área; asimismo, para la muestra en condiciones normales, la respuesta observada es la misma, correspondiendo en el tiempo de retención pero ligeramente superior en área siendo ésta de 14327328 unidades. En el análisis de placebo, no se halló ninguna respuesta en el tiempo de retención del principio activo en análisis, de manera que no hubo ninguna interferencia; sin embargo, manifestó otras respuestas en el intervalo de tiempo de 1 a 2,5 minutos, donde las áreas aportadas fueron de los excipientes: Pseudoefedrina sulfato con respuesta de 2,4 a 2,5 minutos y Esencia de caramelo con respuesta de 1,8 a 2,3 minutos. También se observó que el diluyente aportó respuesta diferente del principio activo en el tiempo de 1 a 1,8 minutos. De acuerdo con la metodología, el diluyente contiene agua purificada, dimetilformamida y fase móvil, de éstos tres, el agua purificada (de forma general) y la fase móvil (ver cromatograma) no manifiestan respuesta habitualmente, así que el diluyente manifestó respuesta solamente por la presencia de dimetilformamida (ver Anexo Nº2). De manera que no se evidenció superposición de picos, por lo tanto, podemos asegurar que el método analítico es específico para analizar Cetirizina diclorhidrato en este producto15.
La Tabla 2 muestra los resultados del parámetro Exactitud, donde se verificó la recuperación del analito en la matriz. Se obtuvo un porcentaje de recuperación promedio de 100,105%, el cual se encuentra dentro del intervalo aceptable 98% - 102%, asimismo, la comparación entre las varianzas de las concentraciones de trabajo es estadísticamente homogénea debido a que el Test G de Cochran dio un
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valor G experimental (0,6692) inferior al G tabla (0,8709) por lo tanto no existe variación significativa entre las varianzas de las concentraciones. Por otro lado, se obtuvo para el Test t-Student un p-valor de 0,646 (> 0,05), el cual confirma que el promedio del porcentaje de recuperación no difiere del valor de referencia que es 100% de manera que son estadísticamente homogéneos19.
La Tabla 3 presenta los resultados del parámetro Precisión, en el cual se pretende verificar la repetibilidad y reproducibilidad del método analítico.
Para Precisión del sistema instrumental, se obtuvo una desviación estándar relativa (DSR) de 0,058% (< 1%) que se encuentra dentro del criterio de aceptación, por tal, la idoneidad del instrumento (equipo) es adecuada para realizar este ensayo. En la parte de Repetibilidad se obtuvo un DSR de 0,427% (< 2%) donde indica que la dispersión de las muestras entre sí es aceptable respecto de la especificación. Asimismo en la Prueba de normalidad según Anderson-Darling el p-valor obtenido es 0,683 (> 0,05) que confirma suficiente significancia estadística para afirmar que el grupo de muestras tiene distribución normal de manera que el valor representativo es el promedio. Respecto a la Precisión intermedia se trabajó con las opciones de diferente analista y diferente equipo. Para Precisión intermedia diferente analista se obtuvo un DSR de 0,436% (< 2%) el cual es aceptable en términos de dispersión, en la prueba de normalidad según Anderson-Darling el p-valor obtenido es de 0,557 (> 0,05) donde al igual que en la Repetibilidad, el valor de tendencia central también es el promedio puesto que presenta distribución normal. Para la comparación de resultados de analistas, al tener 02 grupos de muestras, se utilizó el test estadístico t- Student, donde previamente se realizó el Test F de Fisher para comparar las varianzas de ambos grupos, obteniéndose en éste un p-valor de 0,960 (> 0,05) que brinda la suficiente probabilidad estadística para decir que existe homogeneidad en sus varianzas, y en la prueba T-Student el p-valor fue 0,461 (> 0,05) del cual se confirma que los promedios son estadísticamente homogéneos. En el caso de Precisión intermedia diferente equipo se realizó el ensayo en 07 equipos adicionales obteniéndose los siguientes valores de DSR, 1,060%, 0,548%, 0,562%, 0,559%, 0,854%, 0,601% y 0,388% (< 2%), los cuales son valores aceptables puesto que la dispersión de datos en cada uno de ellos se encuentra dentro de los criterios de aceptación. En la prueba de normalidad según Anderson-Darling se obtuvieron los
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siguientes p-valor 0,534, 0,083, 0,094, 0,082, 0,375, 0,679 y 0,131 indicadores de que los datos en cada grupo de muestra presentan distribución normal y sus valores de tendencia central vienen a ser sus respectivos promedios. Para comparar los resultados en todos los grupos incluyendo la repetibilidad se utilizó el test estadístico de análisis de varianza (ANOVA), para realizar esta prueba fue necesario verificar los supuestos estadísticos de homogeneidad de varianzas con el test estadístico de Bartlett, para comparación de varianzas entre grupos, donde se obtuvo un p-valor de 0,363 que asegura que las varianzas no difieren significativamente entre sí, son estadísticamente homogéneas; asimismo, también fue necesario determinar la prueba de normalidad Anderson-Darling para los datos residuales correspondientes a repetibilidad y precisiones intermedias diferente equipo, en conjunto donde se halló un p-valor de 0,224 (> 0,05) demostrando que éstos si presentan distribución normal y por lo tanto se puede trabajar con la estadística paramétrica, es así que finalmente se aplicó el test de análisis de varianza (ANOVA) donde se obtuvo un p-valor de 0,618 (> 0,05) valor que cumple con la especificación y que determinó con suficiente significancia estadística la homogeneidad de los promedios19.
En la Tabla 4 se muestran los resultados del parámetro Linealidad, donde se busca verificar la proporcionalidad del analito tanto solo (Linealidad del sistema) como acompañado de la matriz (Linealidad del método), es decir, placebo. En Linealidad del sistema se analizó solo principio activo a 05 concentraciones, 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de la concentración nominal de trabajo donde para verificar la relación concentración/respuesta del analito se realizó una regresión lineal por el método de los mínimos cuadrados, en el cual se obtuvo una curva de calibración con una ecuación de la recta y = 140782480,60x + 138759,01 que cumple con el modelo y = bx + a. Se observó un coeficiente de correlación de 1,0000 (> 0,9900), el cual indica una relación dependiente y proporcional entre concentración y respuesta, asimismo para sustentar estadísticamente ese valor se realizó una prueba t-Student donde se obtuvo un t experimental de 301,97 superior al ttabla (2,101) que
corresponde a la elección de la hipótesis alterna donde afirma que el coeficiente de correlación es diferente de cero, por lo tanto no difiere significativamente de 1. Para la variación de la pendiente se halló un DSR de 0,234% (< 2%) que cumple con la
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especificación donde se acepta la dispersión de la proporcionalidad concentración/respuesta, así también la prueba t-Student de la pendiente se observó un t experimental de 427,03 superior al ttabla (2,101) correspondiendo a la hipótesis
alterna, donde la pendiente es diferente de cero, así que no hay diferencia estadística de 1 y de este modo se confirma que existe regresión lineal; de la misma manera para el intercepto se observó un t experimental de 3,95 superior al ttabla (2,101) y al
igual que los anteriores difiere estadísticamente de cero, por tanto la recta de regresión no pasa por el origen de coordenadas, es decir, no es una recta forzada. Para el factor respuesta se observó un valor de 0,778% (< 5%), dentro de lo permitido, así que la dispersión encontrada en los cocientes concentración/respuesta es aceptable. En Linealidad del método se analizó principio activo con placebo en 05 concentraciones 80%, 90%, 100%, 110% y 120% de la concentración nominal de trabajo donde para verificar la relación concentración/respuesta del analito se realizó una regresión lineal por el método de los mínimos cuadrados, en el cual se obtuvo una curva de calibración con una ecuación de la recta y = 140114651,11x + (- 261349,69) que cumple con el modelo y = bx + a. Se observó un coeficiente de correlación de 0,9994 (> 0,9900), el cual indica una relación dependiente y proporcional entre concentración y respuesta, asimismo se realizó una prueba t- Student donde se obtuvo un t experimental de 85,82 superior al ttabla (2,101) que
corresponde a la elección de la hipótesis alterna donde afirma que el coeficiente de correlación es diferente de cero, por lo tanto no difiere significativamente de 1. Para la variación de la pendiente se halló un DSR de 0, 824% (< 2%) que cumple con la especificación donde se acepta la dispersión de la proporcionalidad concentración/respuesta, así también la prueba t-Student de la pendiente se observó un t experimental de 121,33 superior al ttabla (2,101) correspondiendo a la hipótesis
alterna, donde la pendiente es diferente de cero, así que no hay diferencia estadística de 1 y de este modo se confirma que existe regresión lineal; de la misma manera para el intercepto se observó un t experimental de 2,24 inferior al ttabla (2,101) y al
igual que los anteriores difiere estadísticamente de cero, de manera que la recta de regresión no pasa por el origen de coordenadas, es decir, no es una recta forzada. El factor respuesta resultó ser 0,625% (< 5%), dentro de lo permitido, así que la dispersión encontrada en los cocientes concentración/respuesta es aceptable15, 20.
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La Tabla 5 muestra los resultados del parámetro Robustez, el mismo que fue verificado por 02 métodos, Youden-Steiner y Análisis de varianza. Para evaluar los cambios operacionales que se pueden realizar por el método Youden-Steiner, se consideró 07 factores reales haciendo 08 determinaciones siguiendo una matriz aleatoria de modelo factorial. Los resultados de cada factor se detallan en el siguiente orden creciente, Flujo (0,000), Volumen de inyección (0,000), Estabilidad (0,001), T° horno (0,002), pH buffer (0,003), Columna (0,003) y Fase móvil (0,009), todos presentaron un efecto variable permisible ya que ninguno superó al valor del criterio de aceptación que es 0,047; sin embargo, en análisis de impacto entre los mismos, se halló que el factor más influyente y con más probabilidad de alterar el método fue la fase móvil (proporcionalidad entre solventes) que presentó el valor más elevado seguido en menor escala por el pH del buffer y la columna cromatográfica, así que de ser necesario realizar un cambio operacional de intervalo más amplio para estos 03 factores se debería considerar que existe cierta probabilidad de sobrepasar la especificación establecida y en tal caso el método ya no sería robusto; por el contrario, los factores menos influyentes fueron Flujo y el Volumen de inyección que no dieron valor de variación, para los cuales tendrían una permisividad de variación aún más grande que los demás factores12.
Para comparar los resultados por el segundo método en todas las determinaciones se utilizó el test estadístico de análisis de varianza, para realizar esta prueba fue necesario primero realizar la prueba de normalidad según Anderson-Darling a cada determinación, observándose los siguientes resultados del p-valor 0,507, 0,090, 0,610, 0,605, 0,525, 0,074, 0,619, 0,261 (> 0,05) para las determinaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 respectivamente siendo todos aceptables respecto del criterio de aceptación, por tanto el valor de tendencia central en cada determinación es el promedio. También se tuvo verificar los supuestos estadísticos para homogeneidad de varianzas con el test estadístico de Bartlett donde se obtuvo un p-valor de 0,748 valor que asegura que las varianzas no difieren significativamente, son estadísticamente homogéneas; asimismo, también fue necesario determinar la prueba de normalidad de los residuales de las determinaciones en conjunto donde se halló un p-valor de 0,511 (> 0,05) demostrando que éstos si presentan distribución
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normal y por lo tanto se puede trabajar con la parte paramétrica de la estadística, es así que finalmente se aplicó el test de análisis de varianza (ANOVA) donde se obtuvo un p-valor de 0,785 (> 0,05) valor que cumple con la especificación y determinó que los promedios son estadísticamente homogéneos19.