La localització subcel·lular d’1S:GFP va ser estudiada a diferents tipus cel·lulars i al llarg del desenvolupament de les plantes transgèniques. Aquest estudi semblava particularment interessant
en el context de les variacions observades en el patró d’expressió d’1S:GFP. Es van analitzar diferents teixits i tipus cel·lulars de plantes 1S3.11 de 11 després de la germinació. El primer que es va observar és que no totes les cèl·lules d’un mateix teixit expressen 1S:GFP sinó que hi havia un mosaic en quant a presència de la quimera. També s’observaren diferències entre teixits en quant al nombre de cèl·lules amb presència d’1S:GFP. Mentre les zones meristemàtiques de la rel (Figura R.7, panell A)
presenten gairebé un 100% de cèl·lules fluorescents, aquest percentatge és inferior a zones més diferenciades de la mateixa rel (Figura R.7, panell C). Tal i com s’observa a la figura R.7 (panells A, B i C) a les cèl·lules meristemàtiques i diferenciades de la rel, així com a les cèl·lules guarda dels estomes, l’1S:GFP es troba exclusivament al RE. En cada cas la morfologia d’aquest orgànul és la
descrita com a pròpia per al tipus cel·lular corresponent (Ridge et al., 1999). Es pot observar com les cèl·lules meristemàtiques de la rel (Figura R.7, panell A) presenten un RE perinuclear. Possiblement les cèl·lules que no el presenten són cèl·lules en divisió. A la part més diferenciada de la rel, en canvi, s’observa RE cortical amb distribució tubular formant espais poligonal (Figura R.7, panell C). També les cèl·lules guarda dels estomes (Figura R.7, panell B) presenten aquesta distribució cortical.
Figura R.7: Localització subcel·lular de la quimera 1S:GFP a diferents tipus cel·lulars de plantes transgèniques d’A. thaliana. (A) Cèl·lules de la zona meristemàtica de la rel on la major part del RE es troba concentrat perinuclearment. (B) Cèl·lules guarda dels estomes. (C) Cèl·lules diferenciades de la rel on s’observa el RE cortical.
Plantes 1S3.11 van ser crescudes en condicions de dia curt a 22ºC. Als 11 dies després de la germinació van ser observades al microscopi confocal. Les imatges corresponen a projeccions de 10 plans focals. La barra de tamany indica 10 μm.
Resultats
Tenint en compte aquests resultats en plantes de 11 dies després de la germinació va resultar interessant analitzar detalladament a nivell subcel·lular, cèl·lules dels cotiledons i fulles a diferents etapes del desenvolupament.
En primer lloc es van analitzar plantes de 4 dies després de la germinació de la generació T3 de la línea 1S3.11. En augmentar la resolució d’observació mitjançant un microscopi confocal, es va constatar que no totes les cèl·lules presenten fluorescència ni en el cas de tenir-ne, no totes
presenten el mateix nivell d’expressió. Es van analitzar cèl·lules epidèrmiques de la part proximal del cotiledó, propera al pecíol. Aquesta és la zona amb major nombre de cèl·lules amb expressió d’1S:GFP. En aquestes cèl·lules la quimera 1S:GFP localitza majoritàriament al RE, però també a una sèrie de vesícules de morfologia fusiforme que semblaven derivades del RE o en contacte amb ell (Figura R.8, panells A-C i A’-C’).
Així doncs, l’1S:GFP s’acumula en vesícules tant en sistemes d’expressió transitòria, com en plantes transgèniques, però amb una diferència molt significativa. Mentre la morfologia de les vesícules derivades de l’expressió transitòria d’1S:GFP és més o menys esfèrica amb un diàmetre aproximat d’entre 0,5 i 2 μm (Figura R.1, panells A-C; Figura R.4), les vesícules observades a les plantes 1S3.11
són de morfologia fusiforme, amb una llargada entre 5 i 10 μm i una amplada entre 0,5 i 1 μm (Figura R.8, panells A-C). A més, la distribució de la fluorescència és diferent al comparar ambdós tipus de vesícules. En el sistema d’expressió estable a les vesícules només trobem marcatge a la membrana, la qual cosa és coherent amb l’estructura de la quimera, que conté les dues seqüències de transmembrana d’HMGR1S. Per contra, en el sistema d’expressió transitòria la fluorescència
derivada de GFP ocupa tot l’interior de les estructures vesiculars, la qual cosa semblaria indicar la presència de membranes al seu interior.
Resultats
54
A A’
B B’
C C’
Figura R.8: Localització subcel·lular de la quimera 1S:GFP a cèl·lules epidèrmiques de la zona proximal de cotiledó de plantes transgèniques d’A.thaliana de 4 dies després de la germinació. Plantes de la línia 1S3.11 van ser crescudes en condicions de dia curt a 22ºC i als 4 dies després de la germinació els cotiledons van ser observats al microscopi confocal. Les imatges corresponen a projeccions de 10 plans focals consecutius de cada cèl·lula (A-C) i es representen ampliacions de cada cèl·lula per mostrar en detall com 1S:GFP localitza al RE i a vesícules fusiformes associades en ell (A’-C’). La barra de tamany indica 10 μm.
A la zona distal dels cotiledons de plantes d’A. thaliana de 4 dies després de la germinació de la línia 1S3.11 trobem un nombre menor de cèl·lules epidèrmiques que expressen 1S:GFP respecte a la zona
Resultats
55
A B
D
C
exclusivament a la xarxa del RE (Figura R.9, panell A i B). En un menor nombre es troben cèl·lules que tenen una zona d’acumulació de la fluorescència en forma d’agregat (Figura R.9, panells C i D). Igual que en les vesícules derivades de l’expressió transitòria d’1S:GFP en aquests agregats el marcatge
fluorescent no es troba únicament a la membrana sinó que envaeix tota l’estructura i a més és molt intens.
Figura R.9: Localització subcel·lular de la quimera 1S:GFP a cèl·lules de la zona distal de cotiledons de plantes transgèniques d’A.thaliana de 4 dies després de la germinació. Plantes de la línia 1S3.11 van ser crescudes en condicions de dia curt a 22ºC i els cotiledons van ser observats al microscopi confocal. Les imatges corresponen a projeccions de 10 plans focals consecutius de cada cèl·lula on es pot observar que l’1S:GFP està localitzada exclusivament a la xarxa del RE (A, B) o també concentrada en un gran agregat (C, D). La barra de tamany indica 10 μm.
Es posa de manifest doncs, que en plantes de 4 dies després de la germinació, el patró de localització subcel·lular de la quimera 1S:GFP canvia depenen de la zona del cotiledó. Mentre que a la part proximal, l’1S:GFP localitza a la xarxa del RE i a vesícules fusiformes, a la part distal trobem una majoria de cèl·lules amb localització exclusiva a la xarxa del RE, i un nombre reduït de cèl·lules que presenten un gran agregat que concentra la major part de la fluorescència.
Resultats