Para evaluar las relaciones entre los parámetros fisicoquímicos determinados en las aguas de los cinco pozos de Copahue estudiados y los datos de biodiversidad (OTUs designados, recuentos de DAPI y porcentajes de hibridación), se realizaron dos análisis canónicos de correspondencia (ACC).
A través de las herramientas de análisis estadístico que ofrece el programa CANOCO se comprobó que muchos de los parámetros fisicoquímicos determinados en las aguas de Copahue estaban fuertemente correlacionados a la hora de explicar la variabilidad biológica de los pozos estudiados. Así, las variables que explicaban el mayor porcentaje de la varianza del sistema resultaron ser temperatura, pH y conductividad, y fueron las que se utilizaron como variables explicativas (de aquí en adelante, denominadas variables ambientales). La selección de estas variables tiene sentido físico ya que la gran mayoría de las variables que el programa detectó como correlacionadas entre sí, eran las concentraciones de aniones y cationes que, en los valores detectados en las aguas de los pozos de Copahue, no presentan ningún efecto biológico sobre la diversidad de las comunidades microbianas y cuyo comportamiento puede ser representado por la conductividad.
En función de una interpretación más adecuada de los gráficos que se muestran a continuación, se aclara la nomenclatura y simbología que utiliza el programa CANOCO. Los valores de recuentos de DAPI y los porcentajes de hibridación FISH o CARD-FISH con todas las sondas utilizadas se consideraron como especies (representadas en los gráficos por triángulos) en el ACC de la Figura 4.11. En cambio, en el ACC de la Figura 4.12, se consideraron como especies la ausencia o presencia de los OTUs de bacterias acidófilas y todos los OTUs de arqueas.
Tal cual fuera explicado en la Sección 3.9 de Materiales y Métodos, en este tipo de gráficos la intensidad de la correlación entre las especies (representadas por triángulos) y las muestras (los pozos de Copahue representados por puntos azules) con las variables ambientales se mide a través de la proyección perpendicular de estos puntos sobre las flechas rojas de dichas variables (mayor la longitud del segmento determinado por la intersección, mayor la correlación entre esa muestra o especie y la variable ambiental). La intensidad de la correlación entre especies y muestras se mide por la distancia lineal entre sus símbolos.
En el ACC de la Figura 4.11 se muestran los dos primeros ejes porque éstos permiten explicar mayoritariamente (87,2%) la varianza del sistema. La correlación entre especies y variables ambientales es muy fuerte para el primer eje y más débil para el segundo (100% y 36,8%, respectivamente). El valor propio (eigenvalue) para el eje 1 es de 0,872 indicando que el gradiente construido con el juego de datos utilizado es fuerte y válido. El test de Monte Carlo arrojó un coeficiente P de 0,0350 para el eje 1 indicando una buena correlación entre los datos de FISH y las variables ambientales.
Figura 4.11 Análisis canónico de correspondencia (ACC) de los recuentos de
microorganismos realizados con el colorante DAPI y los porcentajes de hibridación con todas las sondas utilizadas (especies) y las variables ambientales temperatura, pH y conductividad. Los nombres de las sondas TM y ACD (de los géneros Thiomonas y Acidiphilium, respectivamente) fueron ligeramente
desplazados para evitar el solapamiento, debido a que sus símbolos se encuentran debajo del que indica al pozo LVE, indicando una correlación total.
-0.6
0.8
-1
.0
1
.0
DAPI EUB BETA GAMMA ALPHA THIO ACD TM ARCH T pH Conductivity LMa1 B9 LMi LVE LS3 SPECIES ENV. VARIABLES SAMPLES ESPECIES VARIABLES AMBIENTALES POZOS E JE 2 ALF EJE 1 GAMnegativamente con el pH. El eje 2 explica solo un 2,1% de la varianza del sistema y muestra apenas una pequeña correlación negativa con la conductividad. Las muestras y las especies están bien distribuidas a lo largo del eje 1. Los pozos B9, LS3 y LMi se correlacionan positivamente con el aumento en la temperatura y en la conductividad y negativamente con el aumento de pH.
El porcentaje de hibridación con la sonda de arqueas (ARCH) está fuertemente correlacionado con el aumento de temperatura y conductividad. Es por eso que los puntos azules que representan los pozos B9, LS3 y LMi, se encuentran del mismo lado del gráfico y correlacionados de la misma manera con estas variables ambientales y especies. Los puntos de los pozos LMa1 y LVE se encuentran del otro lado del gráfico, ya que se correlacionan negativamente con el eje 1 y están muy cerca de los símbolos de la sonda EUB y de las otras de los distintos grupos taxonómicos de bacterias.
Los símbolos de las sondas específicas para los géneros Thiomonas y Acidiphilium (TM y
ACD respectivamente) están debajo del punto del pozo LVE ya que estas sondas hibridaron únicamente con las muestras de agua de este sitio. El triángulo correspondiente a la sonda específica para Alphaproteobacteria (ALF) se encuentra entre los puntos de LVE y LMi ya que
en ambos pozos se detectó aproximadamente un 2% de hibridación con esta sonda. Por último, la concentración de microorganismos, representada a través de los recuentos de DAPI, se encuentra a una distancia intermedia entre los símbolos de las sondas EUB y ARCH, aunque más cerca de esta última, ya que las poblaciones del dominio Archaea fueron algo superiores a
las de Bacteria.
La Figura 4.12 muestra un ACC similar, pero en este caso se utilizaron como especies (triángulos) la presencia o ausencia de los OTUs relacionados con bacterias acidófilas y todos los OTUs de arqueas encontrados. Para este ACC, se necesitaron tres ejes para explicar el 77,1% de la varianza del sistema: el gráfico correspondiente a los ejes 1 y 2 se observa en la Figura 4.12 A y el de los ejes 2 y 3 en la Figura 4.12 B. La correlación entre especies (presencia o ausencia de OTUs) y variables ambientales fue para los tres ejes de 0,996. Los valores propios (eigenvalue) que indican la fuerza de los gradientes construidos por el programa, fueron de 0,896, 0,631 y 0,389 para los tres ejes analizados, respectivamente. El test de Monte Carlo arrojó un coeficiente P de 0,1910 para el eje 1 y de 0,1310 para la suma de todos los ejes.
En el gráfico de ACC de la Figura 4.12, la correlación de los pozos respecto de las variables ambientales y, en particular, temperatura y pH, es aún más clara que en el gráfico de la Figura 4.11. Se observa cómo los cinco pozos se acomodan en el gráfico de acuerdo al aumento en la
OTUs relacionados con arqueas termófilas. El punto que representa a B9 está asociado a dos grupos de OTUs de arqueas termófilas: uno, de especies que están presentes únicamente en B9 y cuyo triángulo cae debajo del símbolo de este punto, y otro que también está correlacionado con LS3 y se encuentra a mitad de distancia entre ambos puntos. En forma similar, el triángulo que representa el OTU asociado con las bacterias acidófilas Hydrogenobaculum se encuentra entre
los símbolos de B9 y LVE ya que secuencias relacionadas con este género fueron encontradas en ambos pozos. Recordemos que ente análisis no se consideró la cantidad de secuencias de cada OTU detectadas en los pozos, sino únicamente la presencia o ausencia de los mismos. Al igual que en el gráfico de la Figura 4.11, del otro lado del gráfico se encuentran los puntos LVE y LMa1 que correlacionan negativamente con el aumento de temperatura y positivamente con el aumento de pH. Además, estos puntos están rodeados por los OTUs de bacterias acidófilas.
En la Figura 4.12 B se muestra la correlación de pozos, especies y variables ambientales para los ejes 2 y 3. Las relaciones entre las especies y los pozos son similares, pero la distribución a lo largo de los ejes cambia y no es clara. Aparentemente, la variable ambiental pH tiene una fuerte influencia en ambos ejes y como los cambios en los valores de pH en las aguas de los pozos son muy pequeños, esto no permite que las especies puedan separarse bien a lo largo de estos ejes.
Figura 4.12 ACC donde se muestra la correlación entre la presencia o ausencia
de OTUs de bacterias acidófilas y todos los OTUs de arqueas (especies, representadas con triángulos) con las variables ambientales temperatura, pH y conductividad. A: representación de ejes 1 y 2 que explican el 61,5% de la varianza. B: representación de ejes 2 y 3 que explican el 77,1% acumulativo de la varianza total. Los microorganismos en los recuadros grises fueron detectados en los pozos a cuyos símbolos están más cercas. Sus triángulos no se ven porque están ubicados debajo de los puntos azules, lo que demuestra correlación total.
-1.0 1.0 -1 .0 1 .0 Thiomonas sp. Acidithiobacillus thiooxidans Acidithiobacillus sp. Acidiphilium sp. Hydrogenobaculum sp.
unc Archaea (Thermoplasmatales) unc Archaea (Thermoplasmatales)
Sulfolobus sp.
Sulfolobus tokodaii "Acidianus copahuensis"
unc Archaea (Sulfolobales) Thermocladium modestius
Vulcanisaeta distributa
unc Archaea (Thermoprotei) T pH Conductivity LMa1 B9 LMi LVE LS3 SPECIES ENV. VARIABLES SAMPLES
A
-1.0 1.0 -1 .0 1 .0 Thiomonas sp. Acidithiobacillus thiooxidans Acidithiobacillus sp. Acidiphilium sp. Hydrogenobaculum sp.unc Archaea (Thermoprotei)
unc Archaea (Thermoplasmatales)
Sulfolobus sp.
Sulfolobus tokodaii Acidianus copahuensis unc Archaea (Sulfolobales)
Thermocladium modestius Vulcanisaeta distributa unc Archaea (Thermoplasmatales)
T pH Conductivity LMa1 B9 LMi LVE LS3