Diversidad y estructura genética de poblaciones de U laevis

Los análisis del ADN del cloroplasto (ADNcp) revelaron que 10 de los olmos analizados en Quitapesares (18 %) tenían el clorotipo A, comúnmente distribuido por el oeste y centro de Europa, y 46 (81 %) el clorotipo B, sólo presente en el sur de Francia y en la Península Ibérica (Whiteley 2004; Fuentes-Utrilla et al. 2013). No se logró amplificar una de las muestras de Quitapesares (1 %). Todos los olmos de Valdelatas (53) presentaban el clorotipo A.

De los 19 microsatélites del ADN nuclear (ADNn) analizados 9 resultaron ser polimórficos (Tabla 4.7), 5 monomórficos (Um1-165, Um1-181, UR138, UR153, UR173) y 5 no amplificaron o produjeron amplificaciones no específicas (Ulm12, Ulmi1-11, Ulmi1-21, Ulmi2-20, UR101). El número total de alelos por loci para los 9 marcadores polimórficos varió entre 2 y 10, siendo la media 4.1. Dentro de cada población, el número de alelos por loci osciló entre 2 y 7, y el número medio fue 3.4. Ambas poblaciones tenían 3 alelos

en Ulm9. La riqueza alélica media de las dos poblaciones era la misma (Ar = 3.4), mientras

que la heterocigosidad observada (Ho) fue superior en Quitapesares (0.48) respecto a

Valdelatas (0.41). La diversidad genética (He) de Quitapesares (0.45) también fue

ligeramente mayor que la de Valdelatas (0.43). La diversidad genética global (Ht) fue 0.48

(Tabla 4.7).

Tabla 4.7 Diversidad y diferenciación genética de las poblaciones estudiadas en base al ADNn.

Global (n=110) Quitapesares (n=57) Valdelatas (n=53) Loci A Ar Ho Hs Ht Dst Fst Fit A Ar Ho He Fis A Ar Ho He Fis Ulm19 4 4.0 0.54 0.58 0.69 0.21 0.26 0.07 3 3.0 0.46 0.49 0.06 4 4.0 0.62 0.68 0.08 Ulm9 6 6.0 0.67 0.68 0.79 0.23 0.25 0.01 6 6.0 0.77 0.76 -0.02 5 5.0 0.57 0.59 0.04 Ulm1-98 3 3.0 0.41 0.37 0.39 0.04 0.09 -0.10 3 2.9 0.25 0.22 -0.12 3 3.0 0.57 0.52 -0.08 Ulm2 2 2.0 0.49 0.42 0.43 0.01 0.03 -0.16 2 2.0 0.56 0.47 -0.20 2 2.0 0.42 0.37 -0.11 Ulm3 3 3.0 0.42 0.39 0.43 0.09 0.18 -0.10 3 3.0 0.58 0.52 -0.12 3 3.0 0.26 0.25 -0.04 UR175 2 2.0 0.23 0.26 0.26 0.00 -0.01 0.11 2 2.0 0.30 0.28 -0.07 2 2.0 0.17 0.25 0.31 UR141 4 4.0 0.53 0.44 0.46 0.04 0.08 -0.20 3 3.0 0.42 0.37 -0.15 3 3.0 0.64 0.52 -0.24 UR158 10 7.8 0.47 0.53 0.54 0.02 0.04 0.11 7 6.8 0.49 0.43 -0.15 7 7.0 0.45 0.63 0.29 UR188 3 2.5 0.25 0.26 0.35 0.19 0.42 0.03 2 2.0 0.48 0.50 0.03 2 2.0 0.02 0.02 0.00 Media 4.1 3.8 0.45 0.44 0.48 0.09 0.17 -0.02 3.4 3.4 0.48 0.45 -0.07 3.4 3.4 0.41 0.43 0.03 n, tamaño de la muestra; A, número de alelos; Ar, riqueza alélica corregida para el tamaño de muestra 53; Ho, heterocigosidad observada; Hs, diversidad genética intrapoblacional; Ht, diversidad genética total; Dst, diversidad genética interpoblacional; Fst, coeficiente de fijación; Fit, coeficiente de endogamia total; He, heterocigosidad esperada; Fis, coeficiente de endogamia intrapoblacional.

Los valores de diversidad genética nuclear, pese a ser bajos, son similares a los observados en otras poblaciones europeas, p. ej., en los Países Bajos He = 0.50 (Nielsen y

Kjær 2010), en un bosque de Dinamarca He = 0.50 y en un bosquete en el mismo país He =

0.39 (Nielsen y Kjær 2010) y en Europa central He = 0.59 (Whiteley 2004; Fuentes-Utrilla et

al. 2013). No obstante, a nivel de ADNcp Quitapesares es más diversa que la mayoría de poblaciones europeas al tener dos clorotipos (Whiteley 2004; Fuentes-Utrilla et al. 2013).

El coeficiente de endogamia de Valdelatas (Fis) no es significativamente distinto de

cero (P > 0.05), mientras que el de Quitapesares es ligeramente negativo (Tabla 4.7) y difiere de cero (P < 0.05), lo que indica un exceso de heterocigosidad en esta población. El coeficiente de endogamia total (Fit) no es distinto de 0 (P > 0.05). Así pues, estos

coeficientes nos indican que no existen problemas de endogamia en estas poblaciones. Estos resultados también corroboran los trabajos previos (Mittempergher y La Porta 1991; Nielsen y Kjær 2010) que determinan que U. laevis es una especie de cruzamiento alógamo y auto-incompatible.

Las poblaciones de Quitapesares y Valdelatas se han diferenciado puesto que la diversidad genética interpoblacional y el coeficiente de fijación son distintos de cero (Dst =

0.09, Fst = 0.17; Tabla 4.7). Esta diferenciación también se aprecia con el análisis de grupos

realizado con STRUCTURE. El número de grupos que mejor se ajustó a los datos (n = 110 muestras) empleando un modelo de mezcla sin datos previos sobre a qué población pertenecían las muestras fue 2. El grupo 1 estaba compuesto por 52 olmos de Valdelatas más 4 de Quitapesares y el grupo 2 por 53 árboles de Quitapesares y 1 de Valdelatas (Fig. 4.10). Esta agrupación de individuos nos indica que casi no hay solapamiento entre las combinaciones alélicas de los nueve microsatélites polimórficos de estas poblaciones. No se encontraron subgrupos dentro de cada una de las poblaciones al analizar los datos de éstas por separado.

Fig. 4.10 Agrupación de individuos inferida con STRUCTURE. Las barras representan las probabilidades de cada individuo de pertenecer al grupo 1 o 2 bajo un modelo de mezcla genética. La línea negra separa los individuos de ambas poblacions y los asteriscos indican los individuos agrupados con los de la población contraria.

El análisis de la estructura genética espacial (EGE) evidenció que en Valdelatas existe una correlación negativa entre el coeficiente de parentesco (Loiselle et al. 1995) y el logaritmo de la distancia (pendiente de la regresión = -0.022; P < 0.0001; Fig. 4.11). Esto implica que a mayor cercanía entre dos individuos existe un mayor grado de parentesco entre ellos. En función de la densidad poblacional efectiva establecida para la estimación, el número de individuos del vecindario (NV) varió entre 44 y 32, y la distancia cuadrática media

de dispersión entre progenitor y vástago (σg) entre 18.8 y 41.3 m. Los primeros valores

corresponden a una densidad efectiva de 100 olmos ha-1 y los segundos a 15 árboles ha-1. Al emplear densidades intermedias se obtuvieron valores dentro de esos rangos. Estos valores son similares a los observados en el bosque de Krenkerup Haveskov (Dinamarca) (Nielsen y Kjær 2010).

Los datos indican una fuerte estructura espacial en Valdelatas que puede haberse 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Prob. grupo 1 Prob. grupo 2

Quitapesares Valdelatas * * * * *

establecimiento de los olmos a las orillas del cauce permanente, generado por las estaciones depuradoras (Fig. 4.12), y por el efecto pantalla que ejercen las copas de las encinas y pinos sobre los propágulos de dispersión (Millerón et al. 2012).

Fig. 4.11 Estructura genética espacial de Quitapesares y Valdelatas. Se ha representado el coeficiente de

parentesco de Loiselle et al. (1995) observado para distintos intervalos de distancias (m) y los intervalos de

confianza obtenidos permutando aleatoriamente 20000 veces las posiciones de los genotipos.

En Quitapesares no se detectó una EGE con el coeficiente de parentesco (Fig. 4.11), por lo que no se pudieron calcular NV ni σg. No obstante, al georeferenciar los haplotipos del

ADNcp se puede observar que 7 de los 10 olmos con clorotipo A de Quitapesares se encuentran agrupados en la parte suroeste de esta población (Fig. 4.12). En los olmos el cloroplasto se hereda vía materna, por lo tanto, esta agrupación de clorotipos nos indica que las sámaras, pese a ser aladas, no se suelen dispersar a grandes distancias. La ausencia de diferencias entre los ejemplares de clorotipo A y B a nivel de ADNn y la falta de EGE en Quitapesares son indicativos de que no hay limitaciones en el flujo polínico local.

Nielsen y Kjær (2010) observaron que las distancias de polinización y dispersión medias de U. laevis en un bosque danés eran relativamente bajas, inferiores a 40 m, aunque en los claros se detectaron distancias de polinización de 1,100 – 1,200 m. Estas distancias son superiores a la registrada entre los dos árboles más distantes de Quitapesares, conque potencialmente todos los individuos de esta población podrían cruzarse entre sí. La topografía plana y baja densidad arbórea debido al encharcamiento y a la transformación humana también favorecen la dispersión de polen en cualquier dirección a mayores distancias, ayudando a que desaparezca una correlación entre el grado de parentesco de dos individuos y la distancia que les separa.

-0.03 -0.02 -0.01 0 0.01 0.02 0.03 0.04 QUITAPESARES (QP) QP IC 95% SUP QP IC 95% INF VALDELATAS (VD) VD IC 95% SUP VD IC 95% INF

Fig. 4.12 Mapa detallado de la ubicación de los clorotipos en Quitapesares y Valdelatas: clorotipo A ( ), clorotipo ( ), olmos no muestreados ( ), olmos apeados antes de la recolección de muestras durante la

En relación a los análisis demográficos hay que destacar que el estadístico M es inferior a 0.68 para Quitaperas y Valdelatas (Tabla 4.8), lo que indica que estas poblaciones han sufrido un cuello de botella ancestral prolongado (Garza y Williamson 2001; Storz y Beaumont 2002). La información que nos proporciona MSVAR es similar, ya que determina que estas poblaciones han sufrido una reducción poblacional y que este declive no es reciente, sino que se inició hace aproximadamente 88,000 años en Valdelatas y 171,000 años en Quitapesares (Tabla 4.8). Al no disponerse dedatos de la probabilidad a priori de las tasas de mutación para el análisis bayesiano (Girod et al. 2011) se han obtenido unos intervalos de confianza muy amplios para los tres parámetros estimados por MSVAR, pero sobre todo para la determinación de los años desde que comenzó el declive (DY; Tabla 4.8).

El test de rango de Wilcoxon, que es el más apropiado para detectar cuellos de botella recientes (Cornuet y Luikart 1996; Luikart et al. 1998; Williamson-Natesan 2005), sólo detecta un cuello de botella en la población de Valdelatas bajo el modelo de mutación de alelos infinitos (IAM; Tabla 4.8). Cabe destacar que el modelo de mutación de dos fases (TPM), que es el que mejor encaja con las evidencias empíricas (Di Rienzo et al. 1994; Garza y Williamson 2001), no refleja ningún cuello de botella (P > 0.05).

Tabla 4.8 Análisis demográficos de las poblaciones estudiadas.

Test de Wilcoxon:

Nº de locus con exceso de heterozygosidad (P-valor)

Población n M IAM TPM SMM

Quitapesares 57 0.56 7 (0.064) 6 (0.248) 6 (0.500)

Valdelatas 53 0.48 7 (0.024) 5 (0.500) 5 (0.820)

Ne [IC 95 %] MSVAR: Media [IC 95 %]

Población ONeSAMP LDNe NPOP NANC DY

Quitapesares 27 [21 - 50] 91 [34 - ∞] 326 [6 – 16,436] 157,435 [3,701 – 6,697,304] 171,002 [3,305 – 8,847,081] Valdelatas 30 [22 - 66] 30 [16 - 89] 210 [4 – 11,290] 372,396 [6,321 – 11,738,159] 87862 [1,768 – 4,365,447] n, tamaño de la muestra.

M, estadístico de Garza y Williamson (2001) que indica un cuello de botella si es inferior a 0.68.

El test de Wilcoxon se realizó con 9 locus empleando: IAM, modelo de alelos infinitos; TPM, modelo de dos fases (20 % varianza y 80 % asignado a SMM); SMM, modelo de mutación paso a paso.

Ne, tamaño efectivo poblacional calculado con ONeSAMP (Tallmon et al. 2008) y con LDNe (Waples y Do 2008). IC 95 %, intervalo de confianza al 95 %.

NPOP, tamaño poblacional actual; NANC tamaño poblacional ancestral; DY, años desde que comenzó el aumento o la reducción poblacional calculados con MSVAR (Storz y Beaumont 2002).

Los registros polínicos también son una potente herramienta para determinar la composición de los bosques y cambios demográficos en el pasado, pero lamentablemente la evolución de U. laevis no puede evaluarse a través de los registros polínicos al no

distinguirse el polen de las tres especies de olmos presentes en la Península Ibérica (Stafford 1995). No obstante, los registros paleobotánicos evidencian que durante el Pleistoceno la Península Ibérica fue refugio glaciar para el género Ulmus (Gil y García-Nieto 1990; López 2000) y la máxima proporción de polen de olmo se alcanzó en el Holoceno, concretamente en los períodos Atlántico (8,000 – 5,000 años BP2) y Subboreal (5,000 – 2,500 años BP). A partir de ese momento, el porcentaje de polen de las especies arbóreas (y de olmos) disminuyó significativamente, aumentando el porcentaje de polen perteneciente a especies agrícolas y herbáceas, lo que nos indica que este cambio se produjo principalmente por la transformación humana del paisaje (López 2000; Valbuena-Carabaña 2010). Teniendo en cuenta los resultados del estadístico M y de MSVAR, todo parece indicar que Quitapesares y Valdelatas sufrieron un cuello de botella genético durante las glaciaciones del Pleistoceno (2,500,000 – 11,000 años BP), lo que encaja con los registros paleobotánicos, aunque el intervalo de confianza inferior de DY (Tabla 4.8) no nos permite

descartar que el cuello de botella se produjera en los últimos 3,500 años.

El tamaño efectivo poblacional (Ne) estimado para Valdelatas es 30 y no varía según

el método empleado para su cálculo (ONeSAMP o LDNe). Quitapesares presenta un Ne

similar (27) si se estima con ONeSAMP, y tres veces superior (90) si se calcula con LDNe, siendo en este caso el intervalo de confianza muy grande (Tabla 4.8). En base a los datos históricos sabemos que las dos poblaciones estudiadas han sufrido recientemente una reducción por causas antrópicas en el número de individuos que las componen. En Quitapesares la reducción se produjo primero por cultivarse parte de la finca y posteriormente por la construcción de un campo de golf y una urbanización. La reducción de Valdelatas se debió al descenso de los niveles freáticos de la zona, a la Guerra Civil Española y a la construcción de un vivero y un hospital. Sin embargo, no se detecta un cuello de botella reciente (test de Wilcoxon), lo que puede ser debido a que la reducción demográfica no ha llevado consigo en ningún caso una reducción severa de Ne. Esta

circunstancia es posible sobre todo si el Ne histórico siempre ha sido pequeño debido a

fluctuaciones en el tamaño poblacional o a la dinámica metapoblacional si se basa en extinciones locales y recolonizaciones (Pimm et al. 1998). En la actualidad el tamaño de estas poblaciones se aproxima a su Ne, por lo que mayores reducciones podrían acarrear un

cuello de botella en las próximas generaciones.

No se observaron brotes de raíz ni se detectó ningún clon en Valdelatas ni en Quitapesares, pero sí se encontraron brotes de cepa en los tocones de algunos olmos

apeados en estas poblaciones. La capacidad de propagación asexual de U. laevis puede jugar un importante papel en la regeneración de poblaciones riparias y en la colonización de nuevos emplazamientos tras una gran avenida (Collin 2003; Deiller et al. 2003). No obstante, en poblaciones de navas o sin grandes avenidas, como Quitapesares y Valdelatas, la regeneración y expansión se consiguen mediante reproducción sexual. La capacidad de brotar de cepa ha ayudado a que la población de Valdelatas no desapareciera cuando se talaba para el aprovechamiento de leñas antes de y durante la Guerra Civil. Esta capacidad de brotar de cepa ha sido descrita como un mecanismo para mitigar los efectos de la fragmentación, prolongando el tiempo entre generaciones, y como consecuencia, evitando la pérdida de alelos por deriva genética (Wei y Jiang 2012).

Resumiendo, el estudio genético muestra que estas dos poblaciones presentan una diversidad genética equiparable o superior a la de las poblaciones europeas y no presentan riesgo de sufrir depresión endogámica. El mayor riesgo al que parecen enfrentarse es a la reducción de hábitat y tamaño poblacional debido a las actividades humanas, que de seguir, podrían provocar un cuello de botella en las generaciones futuras. Es más, en Quitapesares ya no es posible el establecimiento de regenerado puesto que esta población ha sido convertida en un campo de golf.