Ensayos tipo Western Blot

Se sacrificaron un par de animales representativos de cada cepa por medio de dislocación cervical, se obtuvieron bazos e hipocampos. El tejido hipocampal y tejido de bazo se maceraron y posteriormente se lisaron con un buffer que contenía 10 mM de Tris/HCl (pH 7.3) (Merck, Darmstadt, Germany), 2 mM de Na3VO4 (Sigma), 0.4 mM de EDTA

(Baker), 10 mM de NaF (Sigma), 1 mM de Fenilmetanesulfonil fluoro (Sigma), 2 µg/mL de Aprotinina (Sigma), 2 µg/mL de Leupeptina (Roche, Indianápolis, IN) y Nonidet P-40 al 1% (v/v) (Sigma). Cantidades equivalentes de proteína se cargaron en un gel al 10% (SDS-PAGE). Después de la separación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Posteriormente, éstas se incubaron con anticuerpos anti-CD38. Las membranas se marcaron con anticuerpos anti-IgG-HRP de ratón (Zymed). Finalmente, para la detección de las

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proteínas por quimioluminiscencia se utilizó un kit ECL-Plus (Amersham/Biosciences, Buckinghamshire, UK).

2.1.8.3 Laberinto Acuático de Morris 1. Preparación del equipo.

Para tal propósito se utilizó una piscina circular blanca de 150 cm de diámetro y 60 cm de altura. Se acondicionó la habitación con cortinas color claro alrededor de la piscina lo que impidió que el ratón observara al experimentador durante las sesiones de nado. Sobre las cortinas y a la altura del límite de la piscina se colocaron las señales de alto contraste espacial (un cuadro, un círculo, un rombo y una estrella de color blanco con diagonales negras dentro de la imagen).Se colocó una plataforma de PVC de 11cm de diámetro dentro de la piscina. A continuación, se llenó con agua la alberca, hasta por debajo de un centímetro de la superficie de la plataforma y se calentó con resistencias eléctricas hasta obtener la temperatura de 22°C.

2. Preparación del software.

Para poder registrar en video y el tiempo de nado del ratón, se designaron las zonas de interés en el programa OASPADVID (zona de la piscina y zona del cuadrante donde se colocó la plataforma durante el test) y se guardó la información. Posteriormente se registró en el programa un tiempo de 60 s. máximo de grabación en video para cada ensayo, cuando el ratón encontró la plataforma antes de este tiempo, manualmente se detuvo el tiempo de grabación y de igual forma, manualmente se inició la grabación del video del siguiente ratón, previo a guardar el video realizado en una carpeta creada en el disco duro de la computadora (una carpeta por cada día del test y por ratón).

3. Preparación de los animales.

Con la finalidad de identificar a cada ratón de cada especie y dar seguimiento a su evolución dentro del test, cada uno fue marcado con

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un perforador de orejas utilizando un código de identificación personal, y para facilitar su identificación en la caja en el momento de realizar cada intento de nado, también se marcaron con plumón indeleble negro un día antes de iniciar el test y al finalizar cada día después de la sesión de nado.

4. Preparación del experimentador.

Durante todo el periodo de tiempo que duró el test (6 días) el experimentador (que debe ser el mismo de principio a fin) no utilizó perfumes, usó guantes en todo momento y no cambió de desodorante, de jabón o shampoo cuando se bañó, con la finalidad de que el olfato no fuera un factor que pudiera alterar a los ratones y con ello los resultados.

5. Día 1: Plataforma visible (Pre entrenamiento)

Para dar inicio al test, se llenó con agua corriente la plataforma, se calentó con resistencias hasta la temperatura de 22°C y se colocó una pequeña bandera hecha con una pipeta y un trozo de papel morado para incrementar la visibilidad de la plataforma. A continuación, se transfirió uno por uno los grupos de ratones (♂ CD38+/+, ♂ CD38-/-, ♀ CD38+/+ y CD38-/- ♀) desde el área de alojamiento al área de registro de conducta en donde se encontraba la piscina. Se mantuvo al ratón en una caja desde donde no pudo ver la piscina o las pistas espaciales. Posteriormente, para iniciar la prueba con el nado de los ratones, se tomó al ratón número uno por la base de la cola y se apoyó al ratón en la mano mientras se transportó al cuadrante de inicio marcado para ese día. Después se levantó al ratón por la cola y gentilmente se colocó en el agua mirando hacia el borde de la piscina. Rápidamente se le dejó nadar libremente, mientras el experimentador se ocultó tras la cortina. Dos auxiliares estuvieron a cargo del registro del video en la computadora (que se encontró fuera del cuarto con la piscina).Cuando el ratón encontró la plataforma en menos de 60s, se le permitió permanecer en la plataforma otros 10 segundos, y después se regresó

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a su caja (durante el trayecto se secó al ratón con un paño absorbente para evitar hipotermia).Este procedimiento se repitió con cada ratón en cada intento. En total fueron 5 intentos y cada intento subsecuente comenzó con una localización distinta de la plataforma (ver Tabla 3 y Fig. 8) y un punto de inicio de nado diferente (ver tabla 3 y Fig. 8). En preparación para el siguiente día, se removió la bandera de la plataforma, se adicionó agua a la piscina hasta cubrir la plataforma 1 cm por debajo de la superficie y se adicionó colorante para alimentos blanco para hacer opaca el agua de la piscina. En esta etapa una menor latencia de escape se interpreta como mayor memoria de trabajo.

6. Día 2-5: Plataforma oculta (D1-D4)

En estos 4 días del test, se calentó el agua de la piscina a 22°C de ser necesario. La plataforma se colocó en una posición fija en la posición suroeste (SO) y se repitieron los pasos del día 1, desde colocar a los grupos de ratones uno por uno (♂ CD38+/+, ♂ CD38-/- ,♀ CD38+/+ y CD38-/- ♀) en el cuarto de la piscina y se siguieron las instrucciones de inicio de nado de los ratones en cada intento (5 intentos en total por ratón) como se estableció en la tabla 3 (ver Fig.8) Se consideraron las mismas especificaciones de transportación y secado de los ratones como se indicó en el día 1. En esta fase, una menor latencia de escape se interpreta como un mayor aprendizaje.

7. Día 6: Ensayo de exploración o prueba final.

Para la realización de la parte final del test, se removió la plataforma de la piscina y se dejó nadar a cada ratón libremente durante 60 segundos iniciando el nado desde la posición norte (N) (ver Tabla 3 y Fig. 8) y pasados los 60 segundos se retiró al ratón de la piscina (se transportó y se secó al ratón como se indicó en el día 1). En esta fase, un mayor tiempo de permanencia en el cuadrante objetivo (C1) se interpreta como memoria espacial.

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Tabla 3. Protocolo del test de Laberinto Acuático de Morris.

Fuente: Bromley, Deng & Song. 2011. Modificado 2014.

Fig. 8. Test de LAM. A) Sesión 1, preentrenamiento. Se muestran los 4 cuadrantes en los que se divide la piscina y las 5 zonas en las que la plataforma es movida durante la prueba B) Latencia de escape, 4 días de entrenamiento (D1-D4). Se muestra la posición sumergida de la plataforma en el cuadrante suroeste durante los 4 días de entrenamiento. C) Sesión 6, día de la prueba final. Se muestra ejemplo de recorrido del ratón durante la sesión. La zona en color naranja indica el cuadrante donde estuvo localizada la plataforma de escape durante el entrenamiento, y que para esta sesión se ha removido. Fuente: Bromley, Deng & Song. 2011. Modificada 2014.

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