Estudio Genético

El estudio genético se ha llevado a cabo gracias a la colaboración con el Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” y a su accesibilidad e interés. La colaboración para el estudio de los retinoblastomas comenzó en 1999. En todos los casos se han tomado muestras de sangre periférica de los pacientes, así como de sus familiares directos cuando se ha encontrado mutación en la línea germinal, y en los familiares menos próximos cuando se ha precisado y ha sido posible. Así han podido describirse en algunos casos patrones familiares de herencia completos.

Más recientemente se ha incorporado como práctica habitual el análisis genético del material tumoral en los casos enucleados de pacientes con enfermedad unilateral. Para determinar las alteraciones y proceder después al estudio en sangre periférica, que sería fundamental, por ejemplo, en los pacientes del grupo de los “mosaico”.

Diagnostico Molecular. Técnicas.

Para hacer el análisis genético de las muestras tomadas, en primer lugar se realiza PCR para amplificar la región del cromosoma 13 que codifica el gen RB. El análisis posterior se realiza utilizando diversas técnicas (secuenciacion, southern blot y análisis de fragmentos). El análisis de la proteína Rb se realiza con la técnica de western blot.

PCR. Es la técnica que se emplea para amplificar un fragmento de DNA. Esta

técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para

separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Es utilizada para muchos procesos en el campo de la medicina y la biología, por ejemplo, en el diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma. La identificación de mutaciones es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. En el caso del retinoblastoma, se amplifican mediante PCR los 27 exones del gen del retinoblastoma mediante el empleo de unos primers específicos. Una vez obtenidos estos productos de amplificación se someten a secuenciación directa para la identificación de mutaciones puntuales.

Secuenciación. Esta técnica nos permite localizar mutaciones en la secuencia de

ADN. Se emplea así la secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual o de una pequeña delección. La secuenciación automática puede emplearse como método de screening en la localización de nuevas mutaciones.

En el caso concreto del retinoblastoma cada producto de PCR se somete a secuenciación mediante un secuenciador automático (ABI 3100) utilizando la técnica dideoxi que utiliza nucleótidos terminadores marcados con un compuesto fluorescente. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida. . Una vez obtenida la secuencia está se compara manualmente a la secuencia del retinoblastoma descrita. Si una mutación es identificada, está se confirma mediante la realización de una nueva reacción de PCR y de secuenciación.

Análisis de Fragmentos. (Genotipado de ADN) Son técnicas que engloban a

los marcadores moleculares para la identificación. En nuestro caso se ha utilizado la técnica de microsatélites. Esta técnica ha sido utilizada para detectar el patrón de segregación alélica en los casos familiares y la identificación de delecciones intragénicas. Esta técnica también ha sido utilizada para identificar pérdidas de heterozigosidad en tumores.650

Se denomina microsatélite o SSR (Simple Séquense Repeats) a unas secuencias de ADN en las que una secuencia cuyo tamaño va desde un par de bases hasta cuatro pares de bases se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos los cuales se distinguen entre sí por la longitud total del fragmento. Un microsatélite esta típicamente conformado por un motivo repetitivo, en el cual se encuentra contenido la secuencia repetida, y dos regiones flanqueantes, las cuales se encuentran a ambos lados del motivo repetitivo. Para que un microsatélite sea considerado útil como marcador molecular, toda la variación de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del motivo repetitivo, y por el contrario, las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas al punto de no presentar ninguna variación en la secuencia.

Partiendo de estos datos, se diseñan primers o cebadores (uno de ellos marcado con un fluoróforo), para poder amplificar un microsatélite a través de una PCR.

En nuestro caso se han utilizado seis microsatélites extragénicos (tres teloméricos y tres centroméricos) y tres intragénicos. Una vez producidos los correspondientes productos de PCR de cada microsatélite, estos son separados en un secuenciador automático con el objeto de determinar el tamaño de cada alelo Cada alelo se hereda de manera codominante. Un individuo puede presentar un único tamaño de fragmentos, cuando ambos progenitores le han transmitido dos alelos de la misma secuencia y tamaño (homozigosis) o dos tamaños diferentes, cuando cada progenitor ha trasmitido un alelo de tamaño diferente (heterozigosis). Cuando un paciente necesariamente debe ser heterocigótico para un microsatélite (dos tamaños diferentes) en virtud del genotipo de sus padres, pero presenta un único tamaño, entonces uno de los alelos de RB ha sido delecionado (hemizigosis)

Southern blot. La técnica de hibridación o southern blot denominada así en

honor a quien la desarrollo en 1975, se emplea para identificar fragmentos específicos de ADN en una mezcla compleja. Inicialmente se digiere el ADN que queremos estudiar con una o más encimas de restricción, las cuales cortan en puntos específicos de la secuencia, generando fragmentos de varios tamaños. Los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas.

Seguidamente, estos fragmentos se separan por su tamaño en un gel de agarosa empleando corriente eléctrica y luego se transfieren a una membrana de nylon. Para la detección del fragmento de interés en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda (cadena con secuencia de nucleótidos conocida) y que contiene la secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un isótopo radiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana por varias horas. Este hibridación, hace que la sonda se adhiera al fragmento de ADN en la membrana, el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos estudiando. Esta técnica ha sido fundamental en el estudio del ADN. Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.

Diagnóstico genético. Elementos analizados

Todos los elementos que son analizados, son los mismos, tanto cuando el origen de la muestra es la sangre periférica como cuando lo es el tejido tumoral.

DNA genómico o DNA cromosómico es el obtenido desde la muestra, ya sea de

sangre periférica o tumoral, y es sobre el que se trabaja para identificar directamente la mutación afecta. Se amplifica utilizando la técnica de PCR.

DNAc (DNA complementario). Es un ADN de cadena sencilla. Se sintetiza a

partir de una hebra simple de ARNm maduro, que en el caso de las células eucariotas presenta intrones, secuencias no codificantes que deben ser extraídas (con procesos de corte y empalme, splicing) del ARNm antes de ser traducido a proteínas. Este ADN despojado de intrones es el ADN complementario, o ADNc. Aunque existen varios métodos de síntesis, el ADNc es sintetizado casi siempre de ARNm maduro (sin

secuencias intrónicas) utilizando la enzima retrotranscriptasa. Esta enzima trabaja sobre un molde de cadena simple de ARN, creando el ADN complementario basado en la correspondencia de bases ARN (A,U, G, C) con las bases ADN complementarias (T, A, C, G). La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena

de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc). El ADNc se utiliza a menudo en clonación de genes.

Tipo de mutaciones identificadas

Nonsense. Se trata de una mutación puntual en la secuencia de DNA que

codifica un codón de stop en el mRNA, y por tanto a una proteína truncada no funcional.

Frameshift (corrimiento del marco de lectura). Son mutaciones debidas a la inserción o delección de uno o varios nucleótidos. Como en la mayoría de estas ocasiones estas alteraciones no son múltiplos de tres se produce, por la estructura triploide de los codones, un cambio en el marco de lectura. Estos cambios en el marco de lectura dan lugar a la aparición de codones stop prematuros y por tanto a proteínas truncadas no funcionales.

Missense. Es una mutación puntual que altera un nucleótido que conlleva a la síntesis de un codón que codifica para un aminoácido (aa) distinto, lo que puede dar lugar a una proteína con la funcionalidad alterada, o ser un cambio silente, sin alteraciones en la función de la proteína.

Splicing. Estas mutaciones afectan al normal procesamiento del pre-mRNA. Las

mutaciones de splicing afectan a secuencias conservadas en las zonas de frontera entre los exones y los intrones, provocando que el exón afectado sea incorrectamente eliminado durante el procesamiento del pre-mRNA. . De esa manera se crean versiones diferentes del ARN mensajero que dan lugar a proteínas truncadas o aberrantes.

Delección. Es la perdida de parte de la secuencia de DNA, que puede afectar desde un solo nucleótido hasta una parte importante de un gen o de un cromosoma. Si la delección afecta a una parte importante del gen suele tener lugar durante la meiosis. En la mayoría de estos casos no se produce proteína.

Pérdida de heterozigosidad (LOH, loss of heterozigosity). Es un concepto

empleado en ontogénesis, muy utilizado para referirse al retinoblastoma. Se dice que una persona es heterocigota para el gen RB cuando ha heredado una copia mutada de uno de los progenitores, por lo que es heterocigota para ése alelo, lo que no quiere decir que presente enfermedad, cuando se produce el “second hit”, se altera el otro alelo del mismo gen, se pierde la heterozigosidad y aparece la enfermedad. Lo normal es que en el análisis aparezca como heterocigoto en las células germinales y homocigoto en las tumorales; este tipo de alteración se identifica mediante dos procedimientos de análisis de marcadores polimórficos, como son los microsatélites o el análisis de polimorfismo de nucleótido sencillo.