Estudios de compatibilidad entre MSC/P e hidrogeles de fibroína de la seda.

Los estudios de interacción biológica entre la fibroína y las células terapéuticas (MSC/P), fueron realizados tanto in vivo como in vitro, empleando distintos formatos de fibroína. Cabe destacar, las diferencias observadas en el patrón e intensidad de adhesión de las MSC/P sobre los films de fibroína con respecto a diferentes proteínas de matriz extracelular, así como la morfología presentada por estas células al integrarse en los hidrogeles de fibroína.

La adhesión celular es esencial en la comunicación y regulación celular, resultando de vital importancia en el desarrollo y mantenimiento de los tejidos, puesto que las interacciones mecánicas entre una célula y su matriz extracelular (ECM) pueden influir y controlar el comportamiento y la función celular (Khalili & Ahmad 2015). In vitro, la viabilidad y el ciclo celular, así como la comunicación y regulación de las funciones celulares, dependen del anclaje firme al sustrato (Huang & Ingber 1999). Las células se adhieren a otras células o su matriz extracelular mediante sitios de unión, o proteínas transmembrana de anclaje. Estas proteínas transmembrana,

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en su domino extracelular reconocen secuencias aminoacídicas que desencadenan cambios estructurales que son transmitidos al domino intracelular, el cual se encuentra en estrecho contacto con el citoesqueleto a través del complejo de adhesión focal (FA) (Horwitz 1997). Estos cambios estructurales, se traducen en cambios celulares tanto en condiciones fisiológicas, como patológicas (Frenette & Wagner 1996). Las integrinas son las proteínas de anclaje extracelular mayoritarias, aunque también pueden mediar uniones célula-célula, estando implicadas en la mecanotransducción de señales celulares (Honarmandi et al 2011), dirigiendo la migración, proliferación y diferenciación celular (Fournier et al 2005, van der Flier & Sonnenberg 2001). Constituyen una superfamilia de glicoproteínas heterodiméricas (Kaverina et al 2002), compuestas por dos subunidades no covalentes denominadas alfa y beta (Ruoslahti et al 1994). Comúnmente, las integrinas de las MSC/P expresan hasta 10 subunidades tipo α (α1, α2, α3, α4, α5, α6, α7, α10,

αV, αIIb) y hasta 4 tipo β(β1, β3, β4, y β5), y la combinación de estas diferentes subunidades α/β permite el reconocimiento de distintas proteínas de matriz extracelular, como por ejemplo la laminina (α6β1, α6β4, α5β3) o la fibronectina (α3β1, α5β1, α5β3) (Majumdar et al 2003), ambas empleadas en nuestro estudio. Dicho reconocimiento se realiza mediante secuencias aminoacídicas o motivos de adhesión presentes en las proteínas extracelulares, como son los motivos RGD (Arginina-Glicina-Aspártico) (Cutler & Garcia 2003), PHSRN (prolina-histidina-serina- arginina-asparragina) (Aota et al 1994) o el RGDS (arginina-glicina,aspártico-serina) (Pierschbacher & Ruoslahti 1984), estos dos últimos, sólo presentes en la fibronectina (Mas- Moruno et al 2016). In vitro observamos como las MSC/P se adhieren con una menor eficacia inicial a los films de fibroína, con respecto al plástico de cultivo y a la laminina o fibronectina. La expresión diferencial de las integrinas de superficie en las MSC/P y/o la presencia de diferentes motivos de adhesión en las proteínas de la matriz extracelular ensayadas, podría justificar las diferencias observadas en el curso e intensidad de adhesión de las MSC/P durante las primeras 24/72 horas. La ausencia de motivos de adhesión en la fibroína (Zhou et al 2001), que si están presentes en la laminina o la fibronectina, podría justificar las diferencias observadas tanto en el curso de adhesión como en la intensidad de las interacciones. Sin embargo, no justifica la ausencia de diferencias en el tiempo en el que las MSC/P se adhieren a la laminina con respecto a la fibroína, o las diferencias encontradas entre la fibronectina y la laminina. Las diferencias en el patrón de adhesión entre ambas proteínas extracelulares, podrían estar relacionadas con las concentraciones empleadas en nuestros estudios, puesto que se ha demostrado que a iguales o similares concentraciones de ambas proteínas se logra un mayor porcentaje de células adheridas sobre la fibronectina que sobre laminina (Goodwin & Pauli 1995). Otra posibilidad para explicar las diferencias encontradas podría estar atribuída a las diferencias en la secuencia peptídica de ambas proteínas (Tseng & Mortensen 1989). En cuanto a la ausencia de diferencias en el patrón de adhesión celular de las MSC/P a la fibroína y laminina, es posible que la utilización de suero bovino fetal en los ensayos, el cual contiene proteínas de adherencia, hormonas, nutrientes y factores de crecimiento entre otros (Hemeda et al 2014), o la secreción de proteínas de matriz

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extracelular (ECM) a partir de las propias MSC/P (Topoluk et al 2017) hubiese podido interferir con los resultados obtenidos, al evaluar la adherencia de las células a las propias proteínas del suero (Etxebarria et al 2017), o a las secretadas por las MSC/P (Topoluk et al 2017).

Sin embargo, algunos autores defienden que la adherencia celular a la fibroína se produce de forma semi-específica (Zhou et al 2001), puesto que la interacción con el biomaterial se ha demostrado que desencadena y regula la expresión de diversas integrinas de membrana (Sengupta et al 2010). Concretamente, Sengupta S. y col., cultivaron MSC/P sobre “films” de fibroína e identificaron un incremento en la expresión de integrinas tipo α2, α5 y β1. Las integrinas tipo α2 reconocen motivos GER (Glicina-glutámico-arginina), carentes en la fibroína (Zhou et al 2001), sin embargo las integrinas tipo α5 reconocen secuencias tipo RGD o RG”X” (siendo “X” un aminoácido hidrofóbico) (Aota et al 1991). Así, aunque en un bajo número, la fibroína contiene secuencias tipo RGY (arginina-glicina-tirosina) y RGV (arginina-glicina-valina) (Zhou et al 2001) a las que podrían tentativamente adherirse las integrinas α5 presentes en las MSC/P, pudiendo explicar las diferencias en el patrón e intensidad de adhesión observadas en nuestro estudio. Mientras que el reconocimiento de motivos de adhesión RGD (laminina) o RGY/RGV (fibroína), estaría mediado en ambos casos por integrinas tipo α5β1, en el reconocimiento de los motivos RGD, PHSRN y RGDS (fibronectina) participarían una mayor variedad de integrinas α5β1, α5β3,

αIIbβ1 (Mas-Moruno et al 2016), que posiblemente contribuirían a una adhesión más eficaz durante las primeras horas de contacto entre las MSC/P con la fibronectina respecto al resto de proteínas ensayadas. En cuanto a la menor intensidad de adherencia de las MSC/P sobre fibroína se podría explicar en base a la reducida especificidad de unión entre las integrinas y los motivos RGY/RGV presentes en la fibroína (Zhou et al 2001) con respecto a los motivos RGD (laminina y fibronectina) y PHSRN/RGDS (fibronectina) presentes en el resto de proteínas de matriz extracelular ensayadas.

Aun cuando las MSC/P presentaron anormalidades en la adherencia celular sobre fibroína, estas alteraciones no se tradujeron en modificaciones en el crecimiento celular, resultados compatibles con estudios previos donde se ha demostrado que la fibroína constituye un material estructuralmente compatible con la proliferación celular (Wang et al 2006). Hace más de dos décadas, Minoura y col., emplearon en sus estudios fibroblastos murinos y determinaron que en términos de proliferación, los “films” de fibroína eran comparables al colágeno (Minoura et al 1995a, Minoura et al 1995b), si bien es cierto que atribuyeron parte de la adhesión celular a la presencia de sericina en las preparaciones. Años más tarde Gotoh y col., identificaron como los fibroblastos murinos cultivados sobre films de fibroína tanto en su forma nativa como modificados por la adición de residuos de arginina, exhibieron una adhesión y proliferación mayor en estos últimos (Gotoh et al 1998). Si bien es cierto que la adición de secuencias de unión específicas, como el RGD u otras secuencias presentes en la fibronectina, a la cadena peptídica de la fibroína ha demostrado que favorece la proliferación de MSC/P y osteoblastos (Chen et al 2003a, Sofia et al 2001, Widhe et al 2016, Wohlrab et al 2012, Yang et al 2015), en estudios in vivo, se ha

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demostrado que el péptido de adhesión es ligeramente imunogénico, traduciéndose en un incremento de la degradabilidad del biomaterial y una mayor respuesta inmune del tejido trasplantado (Yano et al 2003). En este sentido, se ha sugerido que la existencia de secuencias peptídicas en la fibroína nativa (Yamada et al 2004, Zhou et al 2001) que podrían ser reconocidas de forma semi-específica por las integrinas (Hynes 1992), pueden, aunque en menor medida, estimular mecanismos de proliferación celular (Bai et al 2011, Li et al 2012, Li et al 2009b). Los estudios de Yamada y col., identificaron como “films” de fibroína de base acuosa como los usados en nuestro estudio, promueven la proliferación de fibroblastos en condiciones estándar de cultivo (Yamada et al 2004). Mora-Martinez y col., cultivaron células mamarias humanas, (línea celular MDA-MB-231), empleando un medio condicionado con un 0.4% de fibroína o 0,05% de sericina, observando que ni la proliferación ni el ciclo celular se encontraron comprometidos (Martinez-Mora et al 2012). En nuestro caso, no observamos una disminuida proliferación de las MSC/P en contacto con la fibroína con respecto al crecimiento sobre plástico de cultivo, si bien es cierto que no exploramos si las células cultivadas sobre fibronectina y/o laminina, que presentan motivos de adhesión en su cadena petídica, permiten un mayor incremento del crecimiento celular con respecto a la fibroína en formato de “film”. En cuanto a los estudios de viabilidad realizados sobre este formato de fibroína, al cabo de 8 semanas en cultivo, no identificamos una reducción en la viabilidad de las células cultivadas sobre los “films” de fibroína con respecto a cuando fueron cultivas sobre el plástico de cultivo. Estas observaciones son compartidas por otros autores, que han evaluado la citotoxicidad a corto plazo (4-10 días) sin observar fenómenos de mortalidad/apoptosis relacionados con la presencia del biomaterial, empleando para ello tanto técnicas inmunocitoquímicas, como de citometría de flujo (Rodriguez-Lozano et al 2014, Yang et al 2015). La integración de nanopartículas basadas en fibroína en el interior de células, como vehículo para la liberación de factores (VEGF), ha demostrado la citocompatibilidad de este material, preservando la viabilidad celular de fibroblastos, y una liberación sostenida durante al menos 3 semanas (Kundu et al 2010), confirmando el carácter compatible de este biomaterial con el cultivo celular.

Continuando con los estudios realizados in vitro, y al contrario de los resultados obtenidos con el formato de “film”, el análisis de la proliferación de las MSC/P integradas en los hidrogeles de fibroína indicó que esta población celular fue incapaz de expandirse en el periodo de tiempo estudiado (2 semanas de cultivo). Estos resultados no son compartidos por otros autores que observan, tras analizar el contenido de DNA en el interior de los hidrogeles al cabo de 10-20 días en cultivo, una reducida, pero existente proliferación de las MSC/P integradas en hidrogeles de fibroína (Sun et al 2016, Wang et al 2008a). En los estudios de Wang y col., se emplearon hidrogeles con concentraciones crecientes de fibroína, y observaron como las MSC/P integradas en ellos, presentaron una morfología esferoide, que denotó defectos en la adhesión celular, al igual que en nuestro estudio. Sin embargo, este déficit en adhesión en su caso fue compatible con una reducida proliferación celular (Wang et al 2008a), observada en los primeros 5 días de cultivo,

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tiempo tras el cual, el contenido en DNA permaneció invariable a lo largo del tiempo restante. Es posible, que la metodología empleada en nuestro ensayo, basada en diferencias en el patrón de absorción de la luz (XTT), no fuese adecuada o lo suficientemente precisa, como para denotar pequeños cambios en el contenido celular, imposibilitándonos identificar una limitada aunque existente proliferación celular.

Sin embargo, un aspecto de mayor relevancia y motivo de futuros estudios en nuestro laboratorio, es el análisis del secretoma de las MSC/P integradas en hidrogeles de fibroína, pues es en esta liberación de factores donde se asienta mayoritariamente la actividad terapéutica de las MSCs (Gervois et al 2016, Hsuan et al 2016, Lees et al 2012). En este sentido, Sun y col., pese a la limitada proliferación observada en su estudio, determinaron como el co-cultivo de MSC/P y células endoteliales (OEG) integradas en hidrogeles de fibroína nativos, favoreció la formación de estructuras angiogénicas in vitro, determinando la presencia inmunofenotípica de un marcador de superficie endotelial (CD31), únicamente en presencia de las MSC/P en el cultivo (Sun et al 2016). Otros autores han modificado la secuencia de peptídica de la fibroína añadiendo tropoelastina o poli-L-glutamato, observando como los cultivos de MSC/P además de sobrevivir hasta 4 semanas de estudio, permiten la diferenciación osteogénica en ellos (Calabrese et al 2016). Silvia y col., estudiaron la modulación del secretoma de las MSC/P al integrarse en hidrogeles de “Gellan glue”, hidrogeles compuestos por repeticiones de glucosa, ácido glucurónico y ramnosa, en comparación con hidrogeles de fibroína conjugados con el motivo de adhesión GRGDS presente en la fibronectina (Silva et al 2013). Observaron que no sólo los geles modificados, mejoraron la proliferación de las MSC/P, sino que también incrementaron su actividad metabólica. El medio extracelular obtenido de ambos cultivos, fue empleado sobre el cultivo primario de neuronas de hipocampo de ratas P4 (post-natal), observándose como el medio extracelular de las MSC/P cultivadas en el interior de los hidrogeles modificados, favoreció la proliferación de las NSCs. Del mismo modo un año antes Silvia y col., realizaron un estudio similar en el que se demostró como el secretoma de las células endoteliales en co-cultivo con NSCs, favoreció la proliferación de estas últimas, mediante la secreción de factores como: factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y neurotrofina 3 (NT-3) (Silva et al 2012). Basándonos en estas evidencias previas, podríamos inferir que la integración de las MSC/P en los hidrogeles de fibroína, no altera el secretoma de las mismas. En nuestro caso, aun no pudiendo confirmar dichas afirmaciones, los resultados obtenidos en la presente tesis, muestran no sólo un incremento de la viabilidad celular in vivo tras el implante intra-cerebral, sino además un efecto terapéutico tras su trasplante intra-estriatal en un modelo animal de infarto cortical, sugiriendo una actividad secretora por parte de las MSC/P capaz de promover una neuroprotección/neurorrestauración, co-existente con su integración funcional en los hidrogeles de fibroína.

Los estudios in vivo, muestran como la integración de las MSC/P-EGFP en hidrogeles de fibroína, favorece su supervivencia y viabilidad en el parénquima cerebral, al examinar mediante

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fluorescencia, el contenido de esta población celular en secciones coronales de cerebro a distintos tiempos post-trasplante. Moloney y col., realizaron un ensayo para determinar la eficacia de este fenotipo celular en estudios de localización celular o “tracking” en tejidos (Moloney et al 2010). En su estudio, determinaron el contenido celular tras el trasplante intra-estriatal de MSC/P nativas y EGFP+, delimitando el área fluorescente de las MSC/P-EGFP o bien el área inmuno-reactiva que rodeo a los implantes de células, empleando un anticuerpo anti-GFAP. Determinaron que la emisión de fluorescencia por las células EGFP+ era un signo inequívoco de viabilidad celular, al observar una colocalización de fluorescencia EGFP y un marcador de muerte celular (TUNEL) únicamente en las primeras 24 horas post-trasplante. Utilizando el método de cuantificación indirecta para ambos fenotipos de MSC, no observaron diferencias significativas en cuanto al volumen del injerto ni a la supervivencia, indicando que la expresión de EGFP no afecta a la viabilidad de las MSC/P post-trasplante, siendo capaces de detectar dichas células viables hasta 42 días post-trasplante. Sin embargo, estos resultados no son compartidos por Conye y col., que determinan como el implante de las MSC/P ya sean nativas o EGFP+ presenta un fuerte rechazo en el estriado de ratas más allá de 2 semanas post-trasplante (Coyne et al 2007, Coyne et al 2006). Sugieren que el daño intrínseco al implante intra-cerebral activa la microglía del tejido huésped, sin embargo esta reacción es insuficiente en ambos fenotipos celulares como para inducir el rechazo completo en el tejido, por lo que achacan dicho rechazo a una reactividad intrínseca a las MSC/P, ya sea por la secreción de citoquinas o de proteínas de matriz extracelular, que incrementan la respuesta inflamatoria post-operatoria. Sin embargo, la inflamación intrínseca derivada del trasplante de MSC/P en el parénquima cerebral es motivo de controversia. Rossignol y col., detectaron como la mera inyección de una solución salina, indujo una leve infiltración de los linfocitos T, que no fue observada tras el trasplante de MSC/P, sugiriendo en su trabajo que estas células fueron capaces de inhibir en cierta medida la infiltración leucocitaria en el área de implantación, siendo capaces de detectar las MSC/P hasta 60 días post- implante (Rossignol et al 2009). Dicha afirmación se correlacionó con estudios in vitro, donde las MSC/P evitan la activación de linfocitos T (Dazzi & Marelli-Berg 2008), confirmando así el carácter inmunosupresor y antiinflamatorio de las MSC/P. En nuestro estudio, la pérdida progresiva de MSC/P-EGFP en el cerebro sano de ratones nativos silvestres (WT), podría explicarse por una fuerte reacción inmunológica frente a la proteína EGFP (Cobacho et al 2009, Stripecke et al 1999), o por el fuerte rechazo inducido por las propias MSC/P trasplantadas (Coyne et al 2007, Coyne et al 2006), y como su integración en los hidrogeles de fibroína, que actuarán como una posible barrera física por el reducido tamaño de poro presente en ellos (~100-200 nm), atenuaría el ataque de la respuesta inmune en el tejido huésped, favoreciendo su viabilidad y retención en la localización del implante. La reducida, pero progresiva pérdida del contenido celular trasplantado en el interior de los hidrogeles, podría ser explicado en base a la progresiva degradación del biomaterial por la acción de proteasas, tal y como se discutió con anterioridad, y que dejaría expuestas a las MSC/P-EGFP al microambiente cerebral.

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Pese a esa reducida degradación, y consecuente pérdida del contenido celular, el incremento en la supervivencia de las células observado en nuestro estudio, ha sido reportado empleando: células embrionarias integradas en hidrogeles de ácido hialurónico (Adil et al 2017), agregaciones de células mesenquimales rodeadas de matrices de alginato (Ho et al 2016), NSCs-EGFP integradas en hidrogeles de poli-pétidos (DHC) (Zhang et al 2015c), entre otros (Ballios et al 2015, Chang et al 2012, Jha et al 2015). En estos estudios se sugieren varios mecanismos por los que se observa una mayor viabilidad del injerto cuando es integrado en el interior de matrices tridimensionales; (i) la pérdida de contactos célula-ECM y célula-célula tras el trasplante, podría inducir una apoptosis celular, algo que no sucede al ofrecerles un sustrato al que adherirse tras el trasplante; (ii) la barrera física aportada por el biomaterial impide el ataque inmune tras el daño quirúrgico derivado del trasplante (iii) un efecto paracrino de las propias células contenidas en el interior de los hidrogeles, que favorece su supervivencia. Es posible que una combinación entre los tres mecanismos propuestos, sea la encargada de favorecer una supervivencia de las MSC/P- EGFP a largo plazo en nuestros estudios, y que por tanto el incremento en la viabilidad de las MSC/P trasplantadas terapéuticamente, sea responsable de la recuperación parcial y progresiva exclusiva de los animales trasplantados con SF-MSC.