Las primeras pruebas que se realizaron con la máquina de perfusión desarrollada consistieron en determinar cuál era la temperatura óptima de preservación para los hígados de rata. En la literatura se reportan resultados inciertos, encontramos grupos que sostienen que la perfusión normotérmica o subnormotérmica es superadora con respecto a la hipotérmica 28. Del mismo modo se pueden encontrar grupos que defienden a la perfusión hipotérmica como así también a la perfusión a temperaturas bajo cero sin la formación de hielo 72.
El objetivo principal de esta serie de experimentos consistió en obtener datos preliminares y orientativos respecto de la utilización de dos temperaturas de perfusión diferentes, 10°C y 5°C. Se busca determinar si podemos encontrar una diferencia en el rendimiento del protocolo de preservación de hígados por perfusión hipotérmica.
Figura 26 A) Viscosidad de la solución BGP-HMP en función de la temperatura. B) Viscosidad del H2Od
en función de la temperatura. C) Viscosidad de la solución BGP-HMP con el agregado de diferentes concentraciones de PEG 35K en función de la temperatura. D) Viscosidad de la solución BGP-HMP con el agregado de diferentes concentraciones de HES en función de la temperatura. E) Efecto de la temperatura sobre la viscosidad de diferentes soluciones de preservación con respecto al agua. Viaspan® (solución UW), HTK (solución Custodiol®), BGP-HMP (Bes-Gluconato-Polietilenglicol para máquina de perfusión hipotérmica), BGP-35 (Bes-Gluconato-Polietilenglicol (40 g/L) para el almacenamiento en frío de microórganos hepáticos).
Todos los datos se ajustaron mediante una ecuación exponencial (las ecuaciones se muestran en los gráficos). Las curvas muestran claramente el aumento de la viscosidad debido a la disminución de la temperatura en todas las soluciones estudiadas.
78 Protocolo experimental
Los hígados fueron procurados mediante la técnica quirúrgica a corazón batiente y fueron preservados con la solución comercial Custodiol®. Un grupo fue preservado durante 24 h mediante HMP a una temperatura de 10°C y otro grupo de la misma manera pero a 5°C. Ambos grupos, luego de ser preservados fueron evaluados en el sistema de perfusión ex vivo IPRL (Figura 27).
Grupo experimental Descripción
HTK 5°C Hígados aislados, preservados 24 h por HMP con solución HTK a 5°C y reperfundidos ex vivo.
HTK 10°C Hígados aislados, preservados 24 h por HMP con solución HTK a 10°C y reperfundidos ex vivo.
Resultados y discusión
• Rendimiento durante la preservación por perfusión hipotérmica
Durante las 24 horas que duró la preservación por perfusión hipotérmica se tomaron 4 muestras de la solución de preservación. Por cuestiones de logística de nuestro laboratorio los tiempos elegidos fueron 0, 4, 20 y 24 h. A cada muestra extraída se le midió la concentración de enzimas presentes en la misma, lo cual nos da una idea del daño celular producido por la isquemia fría.
Como era de esperar, para las tres enzimas evaluadas se registró un daño celular producido por la isquemia fría que es progresivo en el tiempo (Figura 28). Para el grupo preservado a 10°C tuvimos una desviación entre experimentos elevada, por lo que, probablemente a causa de ello, solamente encontramos diferencia estadísticamente significativa entre grupos para la enzima AST al tiempo final, siendo
REPERFUSIÓN (90 min IPRL) Flujo portal Resistencia intrahepática LDH, AST, ALT Consumo de O2 Producción de bilis 24 h de HMP HTK a 5 o 10°C Sprague Dawley ♂ (250-300 g) Preservación Procuración Donante clásico LDH, AST, ALT
79 mayor el daño justamente en el grupo preservado a 10°C. De todas formas, para las otras enzimas podemos ver la misma tendencia.
• Rendimiento durante la reperfusión normotérmica Parámetros hemodinámicos - Flujo Portal
En la figura 29 se representa la evolución del flujo que ingresa al hígado por la vena porta y circula por toda su microvasculatura durante la fase de reperfusión del órgano aislado a presión constante. Durante los 90 min de reperfusión normotérmica (37°C), para ambos grupos (HTK 5°C y HTK 10°C, estas temperaturas hacen referencia al período de preservación) se registró un flujo portal casi constante de aproximadamente 2 mL/min.g hig. No se vieron diferencias significativas entre ambos grupos, sugiriendo la ausencia de un efecto sobre los parámetros hemodinámicos que puedan ser atribuidos a las temperaturas de preservación elegidas.
Figura 28. Evolución de la liberación de las enzimas hepáticas LDH, AST y ALT en función del tiempo de perfusión hipotérmica a 5 y 10°C. Cada punto representa la media ± SD de 5
experimentos. *p<0.05
Figura 29. Evolución del
flujo de perfusión en función del tiempo en un sistema aislado. Cada punto denota la media ± SD de 5 experimentos. No se hallaron diferencias estadísticamente significativas.
80 Producción de bilis
La producción de bilis se evaluó a través del cálculo del flujo de la secreción biliar en función del tiempo, como se observa en la figura 30. Los hígados perfundidos luego 24 h de perfusión hipotérmica a 5°C mostraron una alta capacidad de secreción biliar, alcanzando un flujo máximo de 0.47 μL/min.g hig a los 30 min y decreciendo luego hacia el final del período de reperfusión. La producción de bilis de los hígados preservados a 10°C fue menor, sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas.
Liberación de enzimas hepáticas
La acumulación de la enzima ALT (iguales resultados fueron obtenidos para las demás enzimas estudiadas) en el perfusato fue esquematizada en la figura 31. La liberación de enzimas se incrementa con el transcurrir del tiempo de reperfusión normotérmica, por ende el daño celular producido. Para ambos grupos el nivel de daño celular fue similar, por lo cual no encontramos efecto atribuible a la temperatura de preservación.
Figura 30.Flujo biliar. La bilis se recolectó en tubos previamente pesados cada 15 minutos, y el flujo biliar se estimó gravimétricamente en cinco experimentos separados para cada grupo analizado. No se encontraron diferencias significativas para ningún tiempo analizado.
Figura 31. Liberación de la enzima hepática ALT en función del tiempo de perfusión normotérmica. Cada punto representa la media ± SD de 5 experimentos. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos estudiados.
81 Conclusión parcial
En este apartado se exponen los primeros resultados obtenidos utilizando la HMP desarrollada en el marco de ésta tesis. La misma fue aplicada a la perfusión de hígados de rata con la solución de preservación HTK a dos temperaturas diferentes.
Los hígados fueron perfundidos durante 24 h en solución HTK y luego fueron reperfundidos en un sistema aislado (IPRL) que permitió el estudio de diversos parámetros que reflejan el estado de la fisiología hepática. Este modelo in vitro, ampliamente utilizado en la investigación de la fisiopatología del hígado, constituye una alternativa al trasplante hepático experimental muy interesante. Si bien se trata de un sistema aislado y controlado, al mismo tiempo, conserva la complejidad del órgano con sus diferentes tipos celulares interaccionando entre sí y su arquitectura tridimensional intacta. Además, vale la pena destacar que el número de animales para experimentación se reduce a la mitad. No obstante, son numerosas las variables que intervienen en los resultados: temperatura, pH, presión de O2, funcionamiento de la bomba, posicionamiento de los catéteres, elección del perfusato y tiempo de análisis son algunas de las más importantes. Por esta razón, el entrenamiento manual y la estandarización de la práctica, resultan fundamentales y se van desarrollando con el tiempo. Lo expuesto anteriormente explica, en parte, la variabilidad experimental observada en esta serie de ensayos.
Los resultados obtenidos señalaron que la mayoría de los parámetros estudiados no presentaron diferencias significativas entre los grupos estudiados. Durante la perfusión hipotérmica pudimos encontrar un menor daño celular, reflejado en la menor liberación de enzimas hepáticas en el grupo preservado a 5°C. En base a estos resultados y a la diversidad de datos respaldando diversas temperaturas óptimas de trabajo que podemos encontrar en la bibliografía, consideramos utilizar para los próximos ensayos la temperatura de perfusión de 5°C.