EXPERIMENTO I:

Validación del método DCC (DeLaval Cell Counter, DeLaval International A.B., Suecia) como método alternativo para el recuento de células somáticas en leche de oveja en diseños bacteriológicos con pequeños volúmenes de leche.

A partir de 50 ovejas de la raza Assaf y 51 de la raza Churra, en diferentes etapas de lactación, se tomaron 101 muestras de leche cisternal (una muestra por oveja) cuyos recuentos celulares estuvieron comprendidos entre 50 x 10³ y 2.200 x 10³ células/ml. De cada muestra original de leche (60 ml) se tomaron en 10 alícuotas (2 ml/alícuota) diseñadas para estudiar el efecto de 4 tiempos de tinción diferentes, con muestras de leche cruda o diluida, en soluciones de tinción específicas. Los 40 ml restantes se utilizaron para realizar el análisis por el método fluoro-opto-electrónico.

El tiempo de tinción fue definido como el tiempo de permanencia de la leche (cruda o diluida) dentro del casete tomamuestras del DCC, antes de comenzar el procedimiento de recuento celular (es decir, antes de pulsar el botón de inicio del proceso analítico). Este tiempo sería necesario para completar todas las reacciones específicas para la lisis de las membranas celulares y la captación del colorante por los núcleos celulares de la leche de oveja, con un mayor contenido el sólidos totales que la leche de vaca.

Las 10 alícuotas se confeccionaron como se explica a continuación:

a) 4 alícuotas de leche cruda sin diluir fueron analizadas con el DCC, con los siguientes tiempos de tinción: 0 minutos (DCC-0 min), 1 minuto

(DCC-1 min), 2 minutos (DCC-2 min) y 3 minutos (DCC 3 min), respectivamente.

b) 4 alícuotas de leche diluida 1:1 en PBS fueron analizadas con el DCC, con los siguientes tiempos de tinción: 0 minutos (DCC-1:1–0 min), 1 minuto (DCC-1:1–1 min), 2 minutos (DCC-1:1–2 min), y 3 minutos (DCC-1:1–3 min), respectivamente.

c) Las 2 alícuotas de leche restantes se diluyeron al 1:1 en 2 soluciones de tinción (ST) diferentes: solución de tinción de ioduro de propidio (IP) y solución de tinción de bromuro de etidio (BE), y fueron analizadas con el DCC con un tiempo de tinción de 0 minutos (STIP y DCC-1:1-STBE). Estas soluciones de tinción fueron confeccionadas de la manera siguiente:

c.1.) PBS + IP (0.025 mg/mL) + Triton X-100 (0.2%), y c.2) PBS + EB (0.025 mg/mL) + Triton X-100 (0.2%),

Las muestras fueron cargadas inmediatamente en los casetes tomamuestras del DCC después de una suave agitación por inversión de cada muestra 15 veces, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las muestras de leche cruda de oveja fueron también analizadas en el Fossomatic 5000 (Foss Electric, Hillerød, Denmark), como método de referencia para contrastar los recuentos del DCC.

Todos los análisis se realizaron por duplicado. Los análisis en el DCC se llevaron a cabo en el laboratorio a temperatura ambiente y dentro de las cuatro primeras horas posteriores a su recolección. En el caso del uso del aparato Fossomatic, la leche fue calentada a 40º C antes de su análisis en el Fossomatic, el cual fue llevado a cabo

dentro de las 24 primeras horas transcurridas tras su recolección. El volumen de leche utilizado para este análisis fue próximo a 40 ml. A lo largo de la duración del experimento, la precisión y linearidad del método Fossomatic fue calibrada mediante el uso de standards de leche bovina de RCS conocido (entre 0 y 2000 x 10³ células/ml), suministradas por el laboratorio lactológico de Cecalait (Poligny, France). La grasa, proteína y el contenido en sólidos fueron determinados por duplicado en todas las muestras utilizando el Milkoscan FT 6000 (Foss Electric).

Estudio estadístico

Los resultados obtenidos para las 10 condiciones analíticas del DCC, fueron comparadas con los obtenidos con el método Fossomatic, de acuerdo con tres tipos de estudios estadísticos: comparación de medias, desviaciones standard de la repetibilidad y regresión.

La comparación de las medias fue realizada usando un modelo lineal general (procedimiento GLM; SAS Institute Inc., Cary NC). El modelo estadístico usado fue:

Yijkl = µ + Ri + Oj(i) + Ak + RAik + eijkl,

donde Yijkl fue la variable dependiente del log RCS, µ fue la media, Ri fue el efecto de la raza (razas Churra y Assaf); Oj(i) fue el efecto de cada oveja (n = 51 en el caso de la raza Churra, n= 50 en el caso de la raza Assaf, y n = 101 para el total), Ak

fue el efecto de las 11 condiciones analíticas previamente definidas (10 condiciones analíticas del DCC y la del método Fossomatic), RAik fue la interacción raza x condición analítica, y eijkl fue el efecto residual, en el cual se consideraron dos réplicas, ya que las determinaciones analíticas se realizaron por duplicado. El contraste por diferencias entre medias fue llevado a cabo para cada raza y para el total.

La desviación estándar de la repetibilidad (sr y su valor relativo, sr × 100/x, donde x fue la media aritmética de los RCS) para cada uno de las 11 condiciones analíticas, se calculó de acuerdo con el estándar de la Federación Internacional Lechera 128A (Internacional Dairy Federation 1999) usando la fórmula:

12

Donde q es el número de muestras y wi es la diferencia absoluta entre los resultados duplicados de los métodos de RCS.

La desviación estándar de la repetibilidad se estimó para cada raza y para el total.

La regresión lineal fue diseñada para establecer la relación entre el RCS del método Fossomatic, usado como método de referencia, y cada una de las condiciones analíticas consideradas. Debido a que las condiciones analíticas del RCS se realizaron por duplicado (DCC y Fossomatic), previamente se determinó la media aritmética de las dos réplicas. Las estimaciones fueron llevadas a cabo a partir de las 101 observaciones (pares de datos) para cada línea de regresión, y diferenciadamente para 51 y 50 observaciones de las razas Churra y Assaf, respectivamente. El correspondiente punto de corte con la ordenada (a), el coeficiente de regresión (b), y el coeficiente de determinación (R²) fueron estimados en todos los casos usando como método de regresión el procedimiento REG del SAS (SAS Institute Inc.).

Las diferencias entre razas para la grasa, la proteína y el contenido en sólidos fueron estudiadas de acuerdo con el modelo lineal general (procedimiento GLM;

SAS Institute Inc.) usando un modelo matemático, con la raza y el individuo dentro de la raza, como factores de variación para cada variable de composición.