Experimentos de fototermia controlada

incorporado a las células HeLa, se procedió a realizar los experimentos de fototermia controlada. Para ello se utilizó el microscopio de doble haz que fue descrito en el Capítulo 4. En el plano focal de ambos objetivos de microscopio se colocó el portamuestras que contenía las células HeLa a estudio. Uno de los objetivos (60X, NA=0.65) fue utilizado para focalizar el haz proveniente de un diodo láser sin polarizar, consiguiendo un haz de 0.7 µm en el punto focal. Este haz, sintonizado a 808 nm para coincidir con la longitud de onda a la que se encuentra la frecuencia de resonancia de los GNRs actuaba como haz de calentamiento. El segundo objetivo (100X, 0.8NA) fue utilizado para focalizar un haz de 488 nm, consiguiendo un punto focal de 0.4 µm, el cual fue espacialmente superpuesto al haz de calentamiento dentro de una de las células HeLa. La radiación de 488 nm actuaba como excitación óptica de los CdSe-QDs. La emisión de los CdSe-QDs recogida y analizada mediante un espectrofotómetro nos permitía determinar la temperatura intracelular, como ya se explicó en el Capítulo

5. A su vez, un microscopio óptico de transmisión nos servía para monitorizar la

morfología celular en cada paso del experimento.

Un esquema del experimento se puede ver en la Figura 77 (arriba a la izquierda) en el que podemos ver una célula HeLa que tiene en su interior un GNRs y un CdSe-QD. El GNRs es excitado mediante radiación infrarroja, haciendo que se caliente, y la luminiscencia de los CdSe-QDs refleja este calentamiento en la posición del pico de emisión.

Tanto la toma de la temperatura como las imágenes ópticas fueron realizadas esperando en todos los casos el mismo periodo de tiempo (dos minutos), lo que nos asegura que todo nuestro sistema está bajo la misma temperatura.

La viabilidad del sistema experimental descrito queda claramente demostrada en la Figura 77. En esta figura se puede apreciar la temperatura intracelular obtenida mediante el análisis de la luminiscencia de los CdSe-QDs, en función de la potencia del láser de calentamiento. Como era de esperar, hay una relación lineal entre la potencia del láser de 808 nm y la temperatura intracelular.

Nótese que, para potencias láseres relativamente bajas (7.5mW, correspondiente a una intensidad cercana a 240kW/cm²) la temperatura se incrementa en 6°C. Este aumento de la temperatura intracelular es capaz de llevar a la célula (inicialmente a 37°C) hasta el rango citotóxico (42-45°C) (Roti Roti 2008)

Para poder inequívocamente relacionar el calentamiento con la presencia de GNRs, el mismo experimento fue llevado a cabo pero con células HeLa incubadas sólo con CdSe-QDs (experimento de control). El esquema del experimento se puede ver en la Figura 77 (arriba a la derecha) mientras que los datos están incluidos en la misma figura (abajo).

Figura 77. (Arriba izquierda) Representación esquemática del calentamiento intracelular asistido por GNRs y la lectura de la temperatura por los CdSe-QDs. (Arriba derecha) Representación esquemática del mismo efecto pero en ausencia de GNRs. En este caso se espera que no tenga lugar ningún incremento de temperatura. (Abajo) incremento de temperatura intracelular en función de la potencia láser inducida en la célula tanto en presencia como en ausencia de GNRs.

2 4 6 8 0,0 0,5 1,0 

T

(ºC

)



(nm)

808 nm Laser Power (mW)

Está bien claro, a la vista de la Figura 77 que, sin la presencia de nanocalentadores, la radiación láser a 808 nm no causa ningún calentamiento. Por tanto, la única fuente de calor en las células son los GNRs. Es más, se puede concluir que otros mecanismos que podrían aumentar la temperatura (como podrían ser la absorción de la luz por parte de las células) son despreciables, al menos para las potencias láser utilizadas en el experimento y las condiciones de focalización de nuestro trabajo. También es importante señalar que, el aumento de la temperatura también depende de la concentración de GNRs. Utilizar una concentración menor (del orden de 10⁸ cm^-3) llevaba a un incremento de la temperatura despreciable para las potencias láser a las que podíamos llegar en nuestro sistema experimental. Por otra parte, incubar las células con mayores concentraciones de GNRs (del orden de 10¹⁰ cm^-3) llevaba a la aparición de agregados de GNRs y por tanto, de resultados no reproducibles. Por tanto se puede decir que la concentración de GNRs utilizado en este trabajo (del orden de 10⁹ cm^-3) puede considerarse la óptima, al menos para las condiciones experimentales utilizadas en nuestro experimento, como ya se comentó en el

Capítulo 6.

Como se ha mencionado anteriormente, el aumento de temperatura encontrado en el calentamiento intracelular era de 6°C. Esta temperatura podría, en principio, tener efectos en la morfología celular, debido a que se llega a niveles de citotoxicidad celular. Para comprobar estos efectos, realizamos estudios de la morfología celular durante el tratamiento fototérmico. Las imágenes ópticas correspondientes se pueden ver en la Figura 78. En esta figura se confirma que con potencias láser relativamente bajas (4mW, correspondiente a una intensidad cercana a 130kW/cm²), el incremento de temperatura (3°C) produce cambios drásticos en la morfología celular, como se puede ver por la notable aparición de burbujas en la membrana, lo cual es un signo de estrés previo a la muerte celular. Un incremento mayor de calentamiento, con potencias laser de hasta 7.5 mW (~240kW/cm²) produce un incremento de temperatura de 6°C, y podemos ver como la muerte celular se aprecia claramente con la desaparición del núcleo y otros orgánulos celulares. Debido al corto periodo de tiempo (dos minutos) al que las células fueron expuestas a la fuente de calentamiento, el mecanismo de muerte celular por el tratamiento de fototermia más probable debe ser el de necrosis celular. La apoptosis es poco probable ya que involucra transcripción de

genes y daño en proteínas, para lo cual se requiere periodos de tiempo más largos. (Vorotnikova et al. 2006)

Es importante señalar que los efectos hipertérmicos observados en nuestros experimentos están unívocamente relacionados con el calor generado por los GNRs, y por tanto, no se aprecian cambios morfológicos en las células que no han sido incubadas con ellos, a pesar de haber estado expuestas a la radiación láser de 808 nm, como también se puede ver en la parte derecha de la Figura 78 (experimentos de control).

Figura 78. Imágenes ópticas de células HeLa incubadas tanto con la solución de CdSe-QDs y GNRs en PBS (columna de la izquierda) como con sólo CdSe-CdSe-QDs para diferentes intensidades láser a 808nm. El incremento de temperatura causado (medido mediante la fluorescencia de los CdSe-QDs) en cada caso está indicado.