Expresión de los genes de expansina y tratamiento con 1-MCP-Ethrel

Frutos en estadio VG se trataron durante 10 h solo con 1-MCP o con 1-MCP y posteriormente con Ethrel (ver Mat. y Mét., sección 22.2, Figura 51) y se incubaron durante 40 h o 65 h a 24 ºC (se indica como 50 h o 75 h en la Figura 40,

A B C

D E

Figura 39: Tratamiento con Ethrel y expresión de expansinas. Se analizó la influencia del etileno

sobre la expresión de los genes de expansina en frutos en estadio verde grande tratados con Ethrel (EV) y blancos tratados con Ethrel (EB) con respecto a frutos Control sin tratar (CEV o CEB, respectivamente), luego de incubar a 24 ºC durante 48 h.

Las RT-PCRs semicuantitativas se realizaron con cebadores específicos, los fragmentos amplificados se analizaron en geles de agarosa y se transfirieron a membranas de nylon, que fueron hibridizadas con sondas específicas para cada gen de expansina o para el ARNr 18S de frutilla. A: FaEXP1, B: FaEXP2, C: FaEXP4, D: FaEXP5, E: FaEXP6.

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 representando las 10 h de tratamiento con 1-MCP seguidas de 40 o 65 h de incubación, respectivamente). Se analizó la expresión de los genes de expansina en estudio, y los resultados obtenidos se resumen en la Figura 40.

Los resultados para el gen FaEXP1 se muestran en la parte A de la Figura 40. En los frutos incubados durante 40 h a 24 ºC se observó un leve aumento de expresión de este gen en los frutos tratados con 1-MCP (M) con respecto a los frutos control (CM), y luego una disminución con respecto a los frutos M en el grupo

Figura 40: Tratamiento con 1-MCP y Ethrel y expresión de expansinas. Un grupo de frutos VG

fue Control (CM) de frutos tratados solo con 1-MCP (M) durante 10 h o con 1-MCP durante 10 h y luego con Ethrel (ME) e incubados a 24 ºC durante 40 h (50 h en total, indicado en la parte superior) o incubados durante 65 h (75 h, indicado en la parte superior). Los fragmentos amplificados por RT-PCR semicuantitativa de cada gen de expansina (FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6) o del ARNr 18S se analizaron en un gel, se transfirieron a membranas de nylon y se hibridaron con una sonda marcada radiactivamente específica para cada gen. En el caso de FaEXP2 el análisis se realizó por Northern-blot; se transfirieron cantidades iguales de ARN total de cada muestra a una membrana de nylon, se hibridó con una sonda específica para este gen y luego con una sonda para el ARNr 18S. A: FaEXP1, B: FaEXP2, C: FaEXP4, D: FaEXP5, E: FaEXP6.

B

D E

C A

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 tratado primero con 1-MCP y luego con Ethrel (ME). Cuando los frutos se incubaron por 65 h el aumento en la expresión de este gen en frutos tratados con 1-MCP (M) fue más marcado con respecto al control (CM), y la expresión en frutos tratados tanto con 1-MCP y con Ethrel (ME) nuevamente disminuyó con respecto a los frutos tratados solo con 1-MCP (M).

La expresión de los genes FaEXP2 y FaEXP4 luego de los tratamientos se muestran en la Figura 40 B y C respectivamente. Se puede ver que tanto luego de 40 h o de 65 h de incubación, la expresión de estos genes en los frutos control (CM) presenta niveles similares a los detectados en los frutos tratados con 1-MCP (M) o con 1-MCP y Ethrel (ME).

La expresión del gen FaEXP5 (Figura 40 D) mostró un patrón de variación similar al de FaEXP1 (Figura 40 A). En frutos incubados durante 40 h se observó un aumento en los frutos tratados con 1-MCP (M) en relación a la expresión en frutos control (CM), con una disminución de la expresión en frutos tratados con 1- MCP y Ethrel (ME), con respecto a M. Cuando los frutos se incubaron durante 65 h, la expresión en frutos M y ME mostraron niveles similares, que a su vez son mayores que la expresión detectada en el control (CM).

La expresión de FaEXP6 (Figura 40 E) se incrementó en los frutos tratados con 1-MCP (M) incubados durante 40 h o 65 h con respecto a sus respectivos controles (CM); a su vez, el tratamiento posterior con Ethrel (ME) redujo el nivel de expresión en comparación con los tratados únicamente con 1-MCP (M), lo cual fue observado en frutos incubados tanto durante 40 o 65 h.

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3. Discusión

La presencia de un elevado número de genes de expansina es un rasgo característico de las especies vegetales en las que se los ha estudiado (Cosgrove, 2000). Una de las hipótesis acerca de las razones de la gran cantidad de genes de expansina sugiere que la expresión de los mismos es redundante, con lo cual su expresión se solaparía en ciertos casos (Brummell y col., 1999b). Esta redundancia en la expresión se ha detectado en frutilla a través del análisis en distintas variedades durante la maduración (Capítulo I; Harrison y col., 2001; Dotto y col., 2006). De todas maneras, la regulación podría ser diferente para cada gen en cuestión (ver Capítulo I-Discusión). En este sentido, los resultados expuestos en el presente Capítulo indicarían que los genes analizados varían su expresión de diferente manera en frutos sometidos a tratamientos con distintos reguladores de crecimiento. Esto sugiere que el efecto causado por las hormonas, y por lo tanto la regulación de la expresión, sería diferente para cada gen.

En la Tabla VI se resumen los resultados de la influencia de los tratamientos con hormonas sobre la expresión de los genes de expansina, presentados en la Figura 38. Del análisis en conjunto de esta figura puede verse que la aplicación de auxinas exógenas (NAA) resulta en una clara disminución de la expresión de los genes de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP4. No afecta la expresión de FaEXP5 y posiblemente tampoco la de FaEXP6, aunque la señal en la muestra control (C) es muy débil y dificulta la interpretación de los resultados. Esta regulación negativa por la presencia de auxinas se correlaciona con los patrones de expresión observados para estos genes durante la maduración de frutos de Camarosa (Figuras 18 a 22 del Capítulo I). En dicha variedad ninguno de estos genes presenta una expresión importante en el estadio VG, que es donde se ha detectado un máximo en la producción de auxinas (Perkins-Veazie, 1995), con lo cual probablemente el alto contenido de estas hormonas en el fruto tendría relación con el bajo nivel de expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP4. Quizás también las auxinas estén influyendo en el patrón de expresión de FaEXP6, ya que en la Figura 38 E se observa un leve aumento en la expresión en frutos sin aquenios (principal fuente endógena de auxinas), lo cual indicaría que la disminución en el contenido de auxinas produce un aumento en la expresión de este gen. Algo similar es lo que ocurriría en el fruto al pasar del estadio VG, donde hay alto contenido de auxinas, al estadio Blanco donde el contenido de esta hormona es menor. De este modo, el aumento de expresión del gen FaEXP6 entre estos dos estadios de madurez (Figura 22 del Capítulo I) podría estar también influenciado por el contenido de auxinas del fruto. Por último, la expresión del gen FaEXP5 no varió en respuesta a los

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 tratamientos con auxinas (NAA o DEA), pero sí disminuyó en frutos tratados con GA3. Si bien las cantidades de giberelinas presentes en el fruto son muy bajas,

existe un pico de producción en el estadio verde (Perkins-Veazie, 1995), con lo cual es posible que el mayor contenido de esta hormona en el estadio verde esté reprimiendo la expresión del gen FaEXP5 (Figura 21 del Capítulo I), y que la disminución de la cantidad de giberelinas en estadios posteriores induzca el aumento de su expresión. Nótese que el tratamiento con GA3 también afecta

negativamente la expresión de FaEXP1 y de FaEXP2 (Figura 32), por lo que la presencia de esta hormona en frutos verdes también podría contribuir, junto con las auxinas, a la baja expresión de estos genes en el estadio VG (Figuras 18 y 19 del Capítulo I).

Es interesante destacar que en el promotor de FaEXP2 (Capítulo II) se predijo un elemento de respuesta a giberelinas (GARE, Figura 28), así como sitios de unión de factores DOF y una caja de Pirimidinas, que también han sido relacionados con la respuesta a estas hormonas (Mena y col., 2002), lo cual es consistente con la disminución en la expresión de este gen luego del tratamiento con GA3.

Tabla VI

Tratamientos con hormonas y expresión de expansinas

: la expresión del gen aumenta con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada : la expresión del gen disminuye con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada -: la expresión del gen no varía con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada

En frutos tratados con ABA, disminuyó la expresión del gen FaEXP1; aumentó levemente la expresión de FaEXP6, mientras que no se afectó la expresión de FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5. Considerando que el contenido endógeno de ABA es máximo en frutos maduros (Archbold y Dennis, 1984), es probable que esta hormona no tenga un rol importante en los estadios iniciales de la maduración.

AUXINAS ABA GA3 DEA NAA FaEXP1 -    FaEXP2   _-  FaEXP4   _{- -} FaEXP5 - - -  FaEXP6  _-  

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 Dado que los genes de expansina para los que se vio un efecto de esta hormona se expresan en otras partes de la planta además del fruto (Figura 16 del Capítulo I; Harrison y col., 2001; Dotto y col., 2006), es posible que la influencia del ABA sobre la expresión de FaEXP1 y FaEXP6 sea más relevante en otros tejidos de la planta.

También se detectó un elemento de respuesta a ABA (ABRE, Figura 28 del Cap. II) en el promotor de FaEXP2. Sin embargo el tratamiento con esta hormona no afectó su expresión (Figura 38 B). Como se mencionó en el Capítulo II, la predicción de elementos reguladores en cis da lugar a sitios potencialmente reguladores, pero en general su funcionalidad depende, como es el caso de los ABRE, del entorno en que se encuentra dicha secuencia. Probablemente en este caso el sitio predicho no sea funcional por no encontrarse en el entorno adecuado.

El 1-MCP inhibe la acción del etileno en plantas a muy bajas concentraciones, del orden de nl/l (Sisler y col., 1996), y extiende la vida postcosecha de muchos vegetales y frutos, particularmente del tipo climatérico (Blankenship y Dole, 2003).

En frutilla, diversos tratamientos con etileno exógeno y/o con 1-MCP han llevado a algunos autores a proponer que frutos en diferentes estadios de maduración presentarían diferentes niveles de sensibilidad al etileno exógeno. Además, los diversos cambios que se producen durante la maduración (por ejemplo: cambios de color, ablandamiento, variación en el contenido de sólidos solubles, etc.) podrían estar regulados por etileno, pero requerirían diferentes niveles umbral de esta hormona (Tian y col., 2000).

La existencia de receptores de etileno en frutilla fue demostrada hace un par de años (Trainotti y col., 2005). En dicho trabajo se aislaron tres ADNc de receptores de etileno, FaEtr1, FaEtr2 y FaErs2 que resultaron ser homólogos a receptores caracterizados previamente en Arabidopsis. También se aislaron en dicho trabajo dos ADNc de genes involucrados en la biosíntesis de etileno, FaACO1 y FaACO2, que codifican para proteínas que presentan homología a enzimas 1- aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO) de durazno (Ruperti y col., 2001). Se encontró una buena correlación entre la expresión de estos cinco genes durante la maduración con datos previos de producción de etileno en frutilla. También se destaca en dicho trabajo que el receptor mayoritario durante la maduración es

FaEtr2, un receptor tipo II con un dominio degenerado histidina quinasa, y que

dicho receptor requeriría muy pequeñas cantidades de etileno para producir la transducción de la señal. La presencia de un receptor de etileno de alta afinidad en

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 frutilla es coherente con la baja producción de la hormona en este fruto, que es 20 - 2000 veces menor que la existente en frutos climatéricos (Ianetta y col., 2006).

Los resultados mostrados en la Figura 39 indican que el etileno podría tener un efecto como regulador de la expresión de los genes de expansina FaEXP1,

FaEXP5 y FaEXP6, mientras que la expresión de FaEXP2 y FaEXP4 no sería

afectada por la aplicación de etileno exógeno. El efecto sobre la expresión fue más notorio cuando el tratamiento se realizó sobre frutos en estadio Blanco, donde se observa disminución de la expresión de FaEXP1 mientras que no se detectaron diferencias en tratamientos realizados en frutos VG (Figura 39 A). Del mismo modo, la disminución en la expresión de FaEXP5 y FaEXP6 fue más notoria cuando los tratamientos se realizaron sobre frutos Blancos, si bien para estos genes también se observó una leve disminución en experimentos realizados con frutos VG (Figuras 39 D y E). Según los patrones de expresión de los receptores de etileno de frutilla conocidos hasta el momento (Trainotti y col., 2005), la expresión de FaEtr1 y

FaErs2 es baja en frutos VG, mientras que la de FaEtr2 es aproximadamente el

doble que la de los dos anteriores en este mismo estadio. Sin embargo, la expresión de FaEtr1 y FaEtr2 aumenta notablemente cuando los frutos se encuentran en estadio Blanco. Estas diferencias en la expresión de los receptores de etileno podrían correlacionarse con los efectos observados en la Figura 39: la expresión del gen FaEXP1 no se afecta, y la de FaEXP5 y FaEXP6 disminuye levemente, posiblemente por la baja expresión de receptores de etileno en el estadio VG. Al aumentar considerablemente la expresión de estos receptores en frutos Blancos, el etileno exógeno puede ser entonces percibido por los frutos y producir una notoria reducción de los niveles de expresión de estos tres genes.

Cuando se analizó el efecto del 1-MCP sobre la expresión de los genes de expansina, tampoco se observaron diferencias para los genes FaEXP2 y FaEXP4, reforzando la hipótesis de que la expresión de los mismos no está influenciada por etileno. Por el contrario, este tratamiento modificó el nivel de expresión de los genes

FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 (Figura 40). El aumento detectado en la expresión de

estos genes en frutos tratados con 1-MCP (M) con respecto a sus respectivos controles (CM) está de acuerdo con los experimentos realizados con etileno exógeno, sustentando la idea de que el etileno podría estar reprimiendo la expresión de estos tres genes de expansinas en frutilla. De este modo, el tratamiento de frutos VG con 1-MCP bloquea los receptores de etileno impidiendo su percepción, lo cual permitiría que los genes de las expansinas FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 se expresen a un nivel mayor que en los frutos controles.

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 La expresión de los genes FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 fue menor en los frutos tratados con 1-MCP y luego con Ethrel (ME), en relación a los frutos tratados solo con 1-MCP (M), a pesar de que ambos grupos de frutos tendrían sus receptores de etileno inhibidos por el 1-MCP. Dado que el 1-MCP inhibe los receptores al unirse a ellos de modo irreversible, se cree que los frutos tratados con este inhibidor recuperan su capacidad de percibir al etileno a medida que se sintetizan nuevos receptores (Blankenship y Dole, 2003). Asimismo, cabe la posibilidad de que la aplicación de 1-MCP no haya bloqueado la totalidad de los sitios disponibles (Watkins y col., 2000). En frutilla no existe aún información acerca de las velocidades de degradación y síntesis de receptores de etileno. Es posible que la disminución de la expresión de FaEXP5 y FaEXP6, observada 40 h y 65 h después del tratamiento con 1-MCP, se deba a la regeneración de nuevos sitios receptores de etileno, o a que el 1-MCP aplicado no haya inhibido la totalidad de los sitios disponibles, con la consecuente percepción del etileno exógeno y su efecto sobre la expresión génica.

Si bien el etileno generalmente activa la expresión de genes asociados a la degradación de pared, existe un trabajo en frutilla donde se describe la represión de la expresión de uno de estos genes por efecto del etileno (Castillejo y col., 2004). En dicho trabajo se observó una disminución de la expresión del gen FaPE1 en frutos maduros y senescentes luego de la aplicación de etileno exógeno.

Por último, los resultados expuestos para FaEXP2 luego de los tratamientos realizados indican que su expresión varía con el tratamiento de auxinas, lo cual no está totalmente de acuerdo con lo determinado previamente por Civello y col. (1999). En dicho trabajo se concluyó que la expresión de este gen no estaba fuertemente influenciada por auxinas, debido a que la expresión en frutos deaquenados no variaba con respecto al control con aquenios, pero sí se observó una ligera disminución de la expresión tras el tratamiento con NAA, lo cual coincide con los experimentos realizados en esta tesis, tal como se muestra en la Figura 38 B.

Probablemente, las diferencias en la respuesta a auxinas estén relacionadas con las distintas variedades de frutilla utilizadas en cada caso, ya que en el trabajo mencionado se usaron frutos de la variedad Chandler y en este trabajo se usaron frutos de Camarosa. Se ha comprobado (Capítulo I) que la expresión de éstos y otros genes puede variar significativamente en distintas variedades, probablemente a causa de un conjunto de factores (diferente contenido de reguladores del crecimiento, elementos involucrados en mecanismos de transducción de señales,

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 etc.) que difieren entre variedades y que dan origen a los diferentes patrones de expresión observados.

Cabe señalar que en la predicción de elementos reguladores en cis del promotor de FaEXP2 no se detectaron elementos relacionados con la regulación por auxinas (Figura 28, Tabla IV, Cap. II). Sin embargo, como se mencionó en el Capítulo II, el fragmento obtenido es relativamente pequeño, por lo que podrían encontrarse sitios relacionados con respuesta a auxinas en la región promotora aún no conocida.

En cuanto al efecto del etileno sobre la expresión de FaEXP2, Civello y col. (1999) tampoco observaron diferencias en la expresión de este gen entre frutos de la variedad Chandler controles y tratados con etileno, lo cual está de acuerdo con el resultado mostrado en la Figura 39 B; ambos resultados refuerzan la idea de que la expresión de esta expansina no es afectada por el etileno.

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CAPÍTULO IV

1. Introducción

El rápido progreso de la maduración, la senescencia, el daño y las infecciones producidas por insectos, bacterias y hongos son factores determinantes de las numerosas pérdidas, tanto cuantitativas como cualitativas, durante la postcosecha de frutos (Civello y col., 2007). Uno de los principales objetivos de la tecnología postcosecha es controlar estos factores con el fin de mantener la calidad de los frutos y extender su vida postcosecha. El uso de agroquímicos ha sido ampliamente usado con el objetivo de minimizar las pérdidas producidas por pestes y enfermedades. Sin embargo, en los últimos años el uso de muchos de estos compuestos ha sido cuestionado debido al riesgo potencial de los residuos de pesticidas sobre la salud humana y de los riesgos ambientales asociados al uso de algunos productos sintéticos.

En las últimas dos décadas se han hecho numerosos esfuerzos en identificar y desarrollar tecnologías menos riesgosas, como es el caso de los tratamientos físicos, que incluye el uso de atmósferas controladas o modificadas (Kader y col., 1989), tratamientos térmicos (Lurie, 1998a) y exposición a diferentes fuentes de radiación ionizante y no ionizante (Phillips, 1996; Andrews y col., 1998; Bintsis y col., 2000).

Los Tratamientos Térmicos de Alta Temperatura (TAT), o simplemente Tratamientos Térmicos, han sido ampliamente estudiados como posibles tecnologías de conservación para extender la vida postcosecha de frutas y vegetales. Se han utilizado para controlar pestes provocadas por insectos, para evitar el decaimiento de frutos por infecciones fúngicas y para retrasar la maduración (Vicente y col., 2002).

Existen diversas metodologías de Tratamientos Térmicos. En muchos casos se ha utilizado la inmersión de los frutos en agua a alta temperatura durante cortos períodos de tiempo, generalmente unos pocos minutos (Lurie, 1998b). El modo de acción primario de los tratamientos con agua caliente sería la desinfección de los productos tratados debido a la eliminación de esporas de su superficie y de infecciones latentes presentes en las capas internas de la superficie del producto. Además, en algunas especies como cebada (Schweizer y col., 1995), pepino (Stermer y Hammerschmidt, 1984) o uvas (Pavoncello y col., 2001) se ha reportado un aumento en la resistencia contra posteriores inoculaciones con patógenos.