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14. Subfamilia de las ‘Diaphanous-related formins’

5.1.4. FACTORES NEUROTRÓFICOS

Los factores neurotróficos (NTFs) son proteínas secretadas por neuronas, células gliales y tejidos de inervación (músculo, piel,…) que aportan soporte trófico al sistema nervioso. Sirven como factores de crecimiento para el desarrollo, el mantenimiento, la reparación y la supervivencia de poblaciones neuronales específicas. Durante el desarrollo, los NTFs promueven supervivencia neuronal, estimulan el crecimiento axonal y juegan un papel clave en la construcción de la red sináptica normal. En el adulto, ayudan a mantener las funciones y los fenotipos específicos neuronales. Cada vez existen más evidencias que las diferentes familias de NTFs trabajan sincronizadamente y se influyen las unas con las otras.

Existen varias superfamilias de moléculas estructural y funcionalmente relacionadas. En la Figura I27 se muestra la clasificación de las familias de factores neurotróficos en humanos. Se dividen en superfamilia del NGF (factor de crecimiento nervioso), superfamilia del TGF-β

(‘transforming growth factor’) que a su vez consta de la familia del GDNF (‘glial-cell-line-derived neurotrophic factor’) y de la familia de la BMP (‘bone morphogenetic protein’), superfamilia de las neuroquinas y, finalmente, factores de crecimiento no neuronales. En el presente trabajo, nos centraremos en la superfamilia del NGF, ya que es nuestro modelo de estudio.

Figura I27. Clasificación de las familias de factores neurotróficos en humanos. aFGF (‘acidic fibroblast growth factor’), ARTN (artemina), bFGF (‘basic fibroblast growth factor’), CNTF (‘ciliary neurotrophic factor-1’), CT-1 (cardiotrofina-1), EGF (factor de crecimiento epidérmico), IGF-1 (‘insulin-like growth factor’), IL-6 (interleuquina-6), LIF (‘leukemia inhibitory factor’), NTN (neurturina), OCS-M (oncostatin-M), PSP (persefina). Fuente: (Levy et al., 2005).

5.1.4.1. Neurotrofinas

La superfamilia del NGF de mamíferos, originariamente nombrada como neurotrofinas, incluye NGF, BDNF (‘brain-derived neurotrophic factor’) (Leibrock et al., 1989), neurotrofina-3 (NTF3) (Ernfors et al., 1990; Hohn et al., 1990) y neurotrofina 4/5 (NTF4/5). NTF4 se encontró después de un largo periodo de investigación y se clonó finalmente en Xenopus por (Hallbook et al., 1991). Su equivalente en humano, era suficientemente diferente a su homólogo de Xenopus,

que fue considerado un gen diferente y fue llamado NTF5. Más adelante, se dieron cuenta que eran dos genes homólogos y desde entonces se la llama NTF4/5 (Berkemeier et al., 1991; Berkemeier et al., 1992; Ip et al., 1992). Se han identificado dos neurotrofinas adicionales únicamente en peces, NTF6 (Gotz et al., 1994) y NTF7 (Nilsson et al., 1998).

Los genes de las cuatro neurotrofinas de mamíferos codifican para precursores glicosilados de aproximadamente 31-35 kDa, que son cortados por furina y proconversatas para generar las neurotrofinas maduras de 13-16 kDa (ver apartado 5.1.6.5.2.1 Pro-Neurotrofinas) (ver Figura I28). Una vez procesadas completamente, se encuentran en homodímeros unidos no covalentemente y los seis residuos de cisteína conservados en todas las neurotrofinas generan un reorganizamiento que lleva a la formación de tres puentes disulfuro intramoleculares. NGF y NT3 se liberan a través de vías secretoras constitutivas y BDNF es secretada a través de vías reguladas (Roux and Barker, 2002).

Figura I28. Representación de las isoformas de las 4 neurotrofinas de mamíferos. El precursor de BDNF tiene excepcionalmente dos sitios de corte generando la forma madura y una forma incompleta.

La influencia de las neurotrofinas se extiende desde la neurobiología del desarrollo a las patologías neurodegenerativas y psiquiátricas. Aparte de sus efectos clásicos en supervivencia neuronal, las neurotrofinas también regulan el crecimiento axonal, dendrítico y su guía, la estructura sináptica y las conexiones, la liberación de neurotransmisores, la LTP (‘long-term potentiation’) y la plasticidad sináptica. El descubrimiento sorprendente que las neurotrofinas y sus receptores no existían en Drosphila melanogaster o Caenorhabditis elegans refuerza la idea que estas proteínas no son imprescindibles para el desarrollo de los circuitos neuronales per se, pero están involucradas en actividades de orden superior. Influyen en la generación de nuevas conexiones sinápticas y alteraciones en sus niveles produce efectos en muchos fenómenos como mielinización, regeneración, dolor, agresión, depresión, abuso de sustancias,…

Los niveles de neurotrofinas son importantes para determinar la balanza entre supervivencia y muerte celular. Se sintetizan y se liberan de una manera dependiente de actividad. Estudios que expresan niveles reducidos de neurotrofinas muestran efectos sorprendentes en la funcionalidad del cerebro adulto y en comportamiento. Los ratones que tienen una falta completa de neurotrofinas mueren durante las primeras semanas después del nacimiento (Snider, 1994).

Por ello, los estudios se realizan en ratones heterocigotos donde los niveles se ven reducidos a la mitad, lo que hace que sean viables pero muestren fenotipos no esperados (ver tabla IT1).

Ratón NGF+/-

• Inervaciones colinérgicas del hipocampo disminuidas

• Deficiencia en adquisición y retención de memoria

• Pérdida de neuronas del sistema nervioso periférico

Ratón BDNF+/-

Hiperfagia, obesidad

Deterioro de la LTP del hipocampo Niveles elevados de dopamina estriatal Pérdida de sensibilidad mecánica

Pérdida de neuronas del sistema nervioso periférico

Ratón NT3+/-

Defectos cardiovasculares Reducción de mecanoreceptores

Pérdida de neuronas del sistema nervioso periférico

Tabla IT1. Haploinsuficiencia de neurotrofinas. Fuente: (Chao, 2003).

Durante el desarrollo, las neurotrofinas se producen y se liberan desde las células diana y son internalizadas a través de vesículas, que son transportadas mayoritariamente hacia el soma. Los efectos biológicos de las neurotrofinas requieren la convergencia de señales provenientes de largas distancias, desde las terminales nerviosas hasta el soma. Sus receptores, Trk y p75NTR tienen un transporte anterógrado y retrógrado y se ha descrito la asociación de algunas proteínas asociadas a éstos, después de la activación de la neurotrofina, que se transportan con ellos y la señalización persiste incluso después de la internalización. En la Figura I29 se muestra la ilustración de las diferentes rutas por las cuales las neurotrofinas pueden influir, por ejemplo, en la supervivencia neuronal.

Figura I29. Rutas del transporte de neurotrofinas. Se muestran tres grupos de neuronas interconectadas, A, B y C. Las B reciben las neurotrofinas de cuatro fuentes: i) de sus células diana (A) a través de sus axones. Las NTs son internalizadas y transportadas retrógradamente (flechas rojas). ii) de células diana intermediarias o de células gliales situadas a lo largo de sus axones. También se transportan retrógradamente. iii) de las neuronas aferentes, C, que sintetizan en sus somas las NTs y se transportan anterógradamente a lo largo de los axones de C (flechas verdes). iv) a través de una vía autocrina en que el soma de B sintetiza NTs necesarias para ella misma (flechas moradas).

5.1.4.1.1. Distribución de neurotrofinas en el sistema nervioso central Revisado en (Levy et al., 2005)

Pueden encontrarse en diversos tipos neuronales y gliales, destacando en el ganglio trigeminal desde diferentes edades embrionales hasta la edad adulta. Pero sobretodo, la mayoría se localizan principalmente en el hipocampo, a excepción del BDNF, primariamente se localiza en la tercera y quinta capa de neuronas piramidales de la corteza, en el hipocampo, en el núcleo caudado y putamen del cuerpo estriado (Murer et al., 1999) y en la región del soma de las neuronas dopaminérgicas mesolímbicas (área tegmental ventral) (Seroogy et al., 1994). En la Tabla IT2 se muestra un resumen de los distintos tipos de neuronas dianas de las neurotrofinas.

Durante el desarrollo, las NTs se expresan en las diferentes regiones anteriormente mencionadas, pero a la vez estas regiones son invadidas por axones sensoriales en ruta. Esto da soporte trófico a las neuronas que aún no han establecido contacto con sus dianas finales (Farinas et al., 1996; Farinas et al., 1998).

5.1.4.1.2. Descubrimiento del NGF

Por ser la primera neurotrofina descrita y por la relevancia que tuvo su descubrimiento para la neurobiología al sentar las primeras bases del desarrollo del sistema nervioso, le dedicaremos un apartado aparte. También debemos mencionar que el NGF es el principal inductor de neuritogénesis utilizado en nuestro trabajo.

Su descubrimiento se remonta a la década de los años 50, y es básicamente el fruto del trabajo y la dedicación de toda la vida de Rita Levi-Montalcini.

Figura I30. Rita Levi-Montalcini. Recibió el premio Nobel en Fisiología o Medicina, que compartió con Stanley Cohen en 1986, por sus descubrimientos de los factores de crecimiento.

En 1952, bajo la dirección del Dr. Viktor Hamburger en su laboratorio de St. Louis (EE.UU), demostraron que cuando transplantaba tumores de ratón a embriones de pollo, se inducía un enorme crecimiento del sistema nervioso del pollo, especialmente de los nervios sensoriales y

simpáticos. Como dicho crecimiento no requería del contacto directo entre los tumores y el embrión, Levi-Montalcini concluyó que los tumores liberaba un factor promotor del crecimiento nervioso que tenía una acción selectiva sobre un cierto tipo de nervios (Levi-Montalcini and Hamburger, 1951). Seguidamente a este descubrimiento, usaron modelos de cultivo de células primarias para medir la actividad del NGF en varios extractos. Se probó que el NGF era una sustancia biológica extremadamente potente. Las neuronas sensoriales o simpáticas reaccionaban entre los 30 segundos y los próximos minutos al tratamiento con cantidades de NGF del orden de los ng/ml, induciéndose neuritogénesis. Este ensayo biológico condujo a la identificación de la sustancia promotora del crecimiento nervioso. En 1953, se unió al grupo de investigación el bioquímico Stanley Cohen con el objetivo de determinar cual de los componentes del extracto de los tumores de ratón (tanto proteínas como ácidos nucleicos) era el responsable del efecto biológico inductor del crecimiento nervioso. Stanley Cohen añadió veneno de serpiente que contiene altas concentraciones de enzimas degradadoras de ácidos nucleicos y, la sorpresa fue encontrar que el veneno de serpiente contenía más actividad promotora del crecimiento nervioso que el propio tumor (Cohen and Levi-Montalcini, 1956; Levi-Montalcini and Cohen, 1956). El grupo

profundizó en este descubrimiento buscando sistemáticamente la presencia del NGF en varios tejidos, hasta que el 1960, descubrieron otra fuente rica de NGF, la glándula salivar de los ratones macho (Levi-Montalcini and Booker, 1960b). Con la ayuda del veneno de serpiente y del extracto de glándulas salivares, Stanley Cohen pudo purificar la molécula NGF y producir anticuerpos contra ella, que inhibieron el efecto neuritogénico del NGF (Cohen, 1959; Cohen, 1960; Levi- Montalcini and Booker, 1960a). La estructura química del NGF ahora se conoce y está cristalizada. Contiene 118 aa que en forma homodimérica forma la molécula biológicamente activa, llamada β- NGF. En el apartado 7.3.1. de Materiales y Métodos se describe detalladamente su estructura y el protocolo usado para su purificación.