GRXs monotiòliques

Per un altre costat, la GRX monotiòlica Grx5, amb el motiu CGFS al centre actiu, és una proteïna que es localitza a la matriu de la mitocòndria (Rodríguez-Manzaneque et al., 2002). A nivell funcional, la pèrdua de Grx5 comporta defectes de creixement en medi mínim, hipersensibilitat a agents oxidants externs i hipercarbonilació proteica, fets que indiquen dany oxidatiu (Rodríguez-Manzaneque et al., 1999). Com altres GRXs monotiòliques, Grx5 no mostra activitat a l’assaig HEDS (Tamarit et al., 2003). També, l’absència de Grx5 resulta en una acumulació d‘ions de ferro i una disminució de l’activitat dels enzims que contenen centres Fe/S (Herrero i De La Torre-Ruiz, 2007; Rodríguez-Manzaneque et al., 2002), mostrant així que participa en el metabolisme del ferro. Així, els defectes de creixement d’un mutant mancat de Grx5 poden ser deguts a la necessitat d’enzims que contenen centres Fe/S per la biosíntesi de determinats aminoàcids i altres possibles factors de creixement, mentre que la susceptibilitat a determinats oxidants pot ser deguda a tenir unes condicions basals oxidants (Herrero i De La Torre-Ruiz, 2007). Recentment, s’ha demostrat que Grx5 actua com a component de la maquinària d’acoblament de centres Fe/S (sistema ISC), unint la reacció de síntesi de centres Fe/S en Isu1 amb la transferència d’aquests centres Fe/S a les apoproteïnes (Uzarska et al., 2013). Per tal de que Grx5 porti a terme la seva funció, és necessari que tant Isu1 com Grx5 interaccionin amb la xaperona Ssq1. Així, es produeix la transferència dels centres Fe/S de Isu1 a la pròpia Grx5, i aquesta i els seus centres Fe/S permetran la maduració de totes les proteïnes Fe/S cel·lulars, independentment del tipus d’unió al centre Fe/S i de la localització subcel·lular (Uzarska et al., 2013).

Les GRXs monotiòliques Grx3 i Grx4, també amb el motiu CGFS al centre actiu, es localitzen al citosol i al nucli, en aquest segon degut a un domini tipus TRX que tenen a l’extrem N-terminal (Herrero i De La Torre-Ruiz, 2007; Lopreiato et al., 2004; Molina et al., 2004; Mühlenhoff et al., 2010). Aquestes GRXs tampoc mostren activitat a l’assaig HEDS. Grx3 i Grx4 també estan involucrades en el metabolisme del ferro (Mühlenhoff et al., 2010; Ojeda et al., 2006; Pujol-Carrion et al., 2006), ja que ambdós interaccionen amb el factor de transcripció Aft1, el qual respon als nivells de ferro. En condicions de baixa disponibilitat d’ions ferro intracel·lulars, Aft1 es localitza al nucli i activa la transcripció de gens d’un reguló implicats en l’assimilació de ferro. La inhibició de la síntesi de centres Fe/S mitocondrials també causa l’activació del reguló Aft1 (Bellí et al., 2004; Foury i Talibi, 2001; Hausmann et al., 2008), de manera que algunes proteïnes Fe/S mitocondrials podrien actuar com a sensors de l’estat de ferro intracel·lular transferint la senyal corresponent a Aft1 via Grx3/4 (Ojeda et al., 2006; Pujol-Carrion et al., 2006; Rutherford et al., 2005). En absència de Grx3 i Grx4, el factor de transcripció Aft1 està localitzat constitutivament al nucli, desregulant així l’homeòstasi del ferro. En canvi, en presència de Grx3 i Grx4, Aft1 canvia de localització del nucli cap al citosol, sent aquesta redistribució deguda al domini GRX d’aquestes proteïnes (Ojeda et al., 2006; Pujol-Carrion et al., 2006). A part de la interacció amb Aft1, els centres Fe/S que contenen aquestes GRXs in vivo tenen un paper important com a sensors de ferro i en el lliurament d’aquest al citosol (Mühlenhoff et al., 2010). Així doncs, les GRXs monotiòliques Grx3 i Grx4 difereixen significativament de la Grx5 mitocondrial, tot i que tenen funcions reguladores interrelacionades respecte a l’expressió genètica depenent de ferro al nucli i que influencien la disponibilitat intracel·lular d‘ions de ferro per processos biosintètics (Deponte, 2013).

Contràriament a les Grx3-5, les GRXs monotiòliques Grx6 i Grx7 tenen una activitat oxidoreductasa significativa en l’assaig HEDS tant in vitro com in vivo. De fet, Grx7 presenta més activitat que Grx6 en aquest assaig (Izquierdo et al., 2008; Luo et al., 2010; Mesecke et al., 2008a; Mesecke et al., 2008b), però considerablement menys que l’activitat de les ditiòliques Grx1 i Grx2 (Izquierdo et al., 2008; Mesecke et al., 2008a). A més a més, Grx6 també presenta activitat GST, fins i tot més alta que la de Grx1 i Grx2 (Luo et al., 2010). De fet, l’estructura cristal·lina del domini GRX C-terminal de Grx6 mostra l’estructura GRX típica amb un plegament tipus TRX, i només es diferencia de les GRXs ditiòliques Grx1 i Grx2 per la presència de dos cadenes β

[Figura 4]. Per tant, tant l’estructura primària com l’activitat enzimàtica d’aquestes indica que Grx6 i Grx7 són més semblants a les GRXs ditiòliques que a les GRXs monotiòliques [Figura 3A i B]. Grx6 i Grx7 consten de 231 i 203 aminoàcids, amb els centres actius CSYS i CPYS, respectivament, i mostren un 45% d’identitat de seqüència entre elles (Mesecke et al., 2008b).

Grx1 Grx6

Figura 4. Estructura tridimensional de la proteïna Grx1 glutationilada (codi PDB 3C1S) i de la

Grx6 monomèrica (3L4N) de S. cerevisiae, representades utilitzant el programa “Swiss- PdbViewer 4.0.1” (Herrero et al., 2010). Els residus de cisteïna del centre actiu, així com altres residus importants per la interacció amb el GSH, estan indicats. Els dominis de l’estructura secundària també estan marcats. Veure Luo et al. (2010) i Yu et al. (2008) per més detalls de l’estructura de Grx1 i Grx6 respectivament. En el cas de Grx6 només s’ha determinat l’estructura del domini GRX.

Aquestes GRXs estan localitzades a la via secretora, amb una distribució de Grx6 entre les vesícules del RE i l’aparell de Golgi, mentre que Grx7 es troba majoritàriament sinó completament a les vesícules de l’aparell de Golgi, ambdues amb el domini GRX encarat al lumen d’aquests orgànuls i unides a la membrana per un domini TM de l’extrem N-terminal (Izquierdo et al., 2008; Mesecke et al., 2008b). Tot i que es coneixen homòlegs d’aquestes GRXs en fongs, plantes i Caenorhabditis

elegans, aquest domini TM (i per tant la localització subcel·lular de les molècules)

però no Grx7, està modificada post-traduccionalment per l’addició d’O-oligosacàrids als compartiments de la via secretora. La seva distribució asimètrica a la cèl·lula explica aquestes diferències en el patró d’O-glicosilació, el qual és més extens en Grx6. El que no es coneix és si hi ha molècules de Grx6 que s’estan movent contínuament del RE a l’aparell de Golgi i viceversa, o bé hi ha subpoblacions permanents en ambdós compartiments (Izquierdo et al., 2008) [Figura 5].

Grx3 Grx4 Grx6 Grx6 Grx7 Grx1 Grx2 Grx8 Grx2 Grx5 CITOSOL NUCLI RE APARELL DE GOLGI VACUOLA MITOCÒNDRIA

Figura 5. Localització cel·lular de les GRXs descrites en S. cerevisiae.

A més a més, l’anàlisi de les seqüències dels seus respectius promotors (Izquierdo et al., 2008) indica que el promotor de GRX6 té un element de resposta a la via de la calcineurina (veure apartat 4.1.2 de la Introducció). En determinades condicions d’estrès, com l’exposició a alts nivells de Ca2+ _{o Na}+_{, o bé un xoc tèrmic, la via de la}

calcineurina permet que el factor de transcripció Crz1 reconegui aquests elements en els promotors de determinats gens per induir-ne l’expressió (Yoshimoto et al., 2002).

En canvi, el promotor de GRX7 posseeix un element de resposta a estrès (STRE), el

qual es reconegut pel factor de transcripció Msn2/Msn4, que regula una resposta general a un estrès ambiental, com ara l’exposició a un xoc tèrmic, osmòtic o oxidatiu, entre altres (Estruch, 2000). Així doncs, els factors de transcripció Crz1 (per GRX6) i

Msn2/Msn4 (per GRX7) podrien regular directament l’expressió d’aquestes GRXs a nivell transcripcional en determinades condicions d’estrès (Izquierdo et al., 2008).

Grx6 i Grx7 són les primeres GRXs monotiòliques en les quals s’ha demostrat la formació de dímers units no-covalentment (Mesecke et al., 2008a). No obstant, aquestes tenen diferents propietats d’oligomerització. De fet, Grx6, però no Grx7, també pot formar dímers via un enllaç disulfur intermolecular. A més a més, només Grx6 pot formar tetràmers amb l’ajut d’un centre Fe/S. Així, els dímers associats no- covalentment es poden oxidar resultant en un pont disulfur intermolecular, o poden unir un centre Fe/S provocant la unió de dímers. En canvi, la conversió del tetràmer de Grx6 al dímer estable es produeix amb la pèrdua del centre Fe/S. Aquesta pèrdua pot ser deguda a una oxidació, donat que el GSH (però no el GSSG) estabilitza el centre Fe/S, com també ho fa l’àcid ascòrbic i l’agent reductor ditiotreitol (DTT), encara que aquests últims més dèbilment (Luo et al., 2010; Mesecke et al., 2008a). Així doncs, Grx6, a diferència de Grx7, uneix un centre Fe/S estabilitzat per GSH in vitro, resultant en la pèrdua de l’activitat oxidoreductasa (Mesecke et al., 2008a). També s’ha descrit que Grx6 uneix ions de ferro in vivo, però amb baixa afinitat (Izquierdo et al., 2008), fet que fa especular un possible paper de Grx6 en el metabolisme del ferro. El fet que Grx6 pugui unir centres Fe/S, mentre Grx7 no, és degut a les diferències en el centre actiu que existeixen entre elles, en concret al residu de Pro del centre actiu de Grx7 que dificultaria la interacció amb el centre Fe/S (Berndt et al., 2007; Mesecke et al., 2008a; Rouhier et al., 2007).

Varis experiments genètics suggereixen que ambdues proteïnes contribueixen in vivo a l’homeòstasi redox en l’ambient oxidant de la via secretora (Izquierdo et al., 2008; Mesecke et al., 2008b). De fet, s’han descrit possibles relacions funcionals entre aquestes GRXs i l’estrès d’aquests compartiments. Per exemple, treballs previs del nostre grup mostren que l’estrès de RE causat per l’agent tunicamicina (un inhibidor de la N-glicosilació) causa una inducció de l’expressió d’aquestes GRXs (Izquierdo et al., 2008).

Per tant, Grx6 i Grx7 són GRXs monotiòliques enzimàticament actives amb funcions hipotètiques a la via secretora, de les quals en principi encara no es coneixen ni els substrats fisiològics ni les seves possibles interaccions amb altres proteïnes.