1.7.1 Reactivos generales
Buffer de electrodo: Hidroximetil aminometano-base (Tris-base) 0,125 M, glicina 0,96 M (pH 8,3), con o sin el agregado de dodecil sulfato de sodio (SDS) 0,5% p/v, para electroforesis desnaturalizante o no desnaturalizante respectivamente.
Buffer de gel separador: Tris-base 1,5 M (pH 8,8) con o sin el agregado de SDS 0,4% p/v. N´, N´, N´, N´, tetrametiletilendiamina (TEMED) 0,4% v/v.
Buffer de gel stacking: Tris-base 0,5 M (pH 6,8) con o sin el agregado de SDS 0,4% p/v.
Buffer de extracción:
• NATIVE-PAGE (no desnaturalizante) y SDS-PAGE (mono y bidimensional): Trisma base 0,0625 M (pH 10).
• Multistacking (MS-SDS-PAGE): Trisma HCl 0,125 M (pH 6,8), SDS 2% p/v, Glicerol 10% v/v, Azul de bromofenol 0,01% p/v, con o sin el agregado de 2- mercaptoetanol 5% v/v, para obtener condiciones reductoras o no reductoras, respectivamente.
Buffer de muestra: Trisma base 0,0625 M (pH 10), glicerol 12,5% v/v, y azul de bromofenol 0,05% p/v, con o sin el agregado de dodecil sulfato de sodio (SDS) 2,0% p/v, para electroforesis desnaturalizante o no desnaturalizante respectivamente.
Buffer de tratamiento para electroforesis bidimensional: Tris-HCl 62,5 mM (pH=6,8), SDS 1% p/v, sacarosa 20% p/v, 2-mercaptoetanol 0,2 M.
Patrones de proteínas de baja masa molecular (LMW): Los patrones LMW utilizados en las corridas de electroforesis y para el cálculo de las masas de los polipéptidos fueron: fosforilasa b (97 kD); albúmina (66 kD); ovoalbúmina (45 kD); anhidrasa carbónica (30 kD); inhibidor de tripsina (20,1 kD) y α-lactoalbúmina (14,4 kD) (GE Healthcare, Inglaterra). Las proteínas patrón fueron solubilizadas en 200 µl de buffer de muestra desnaturalizante con β-mercaptoetanol. Se construyeron curvas de calibración relacionando el factor distancia recorrida por las distintas proteínas, con el logaritmo de su peso molecular.
1.7.2 Extracción de las proteínas
La extracción de proteínas de las muestras de gluten y masa liofilizadas fue realizada por duplicado con buffer Trisma base 0,0625 M (pH 10) para las electroforesis NATIVE-PAGE (sólo se realizó para las muestras de masa), SDS- PAGE y 2D-SDS-PAGE (sólo se realizó para las muestras de gluten). Para estas dos últimas técnicas no se agregó SDS al buffer para evitar que este agente desnaturalizante interfiera en la interacción que se genera entre los emulsificantes y las proteínas del gluten. En la electroforesis MS-SDS-PAGE se utilizó el buffer Trisma HCl 0,125 M (pH 6,8), SDS 2% p/v, Glicerol 10% v/v, Azul de bromofenol 0,01% p/v.
La cantidad de muestra utilizada en cada electroforesis fue la siguiente: - NATIVE-PAGE: 80 mg masa/mL buffer
- SDS-PAGE: 30 mg gluten/mL buffer y 80 mg masa/mL buffer - 2D-SDS-PAGE: 50 mg gluten/mL buffer
- MS-SDS-PAGE: 30 mg gluten/mL buffer y 60 mg masa/mL buffer
Todas las muestras, antes de ser sembradas en el gel correspondiente, se centrifugaron a 9.350 x g durante 15 min a 4 ºC en microcentrífuga IEC-Centra MP4R (EUA). El sobrenadante fue mezclado en partes iguales con el buffer de muestra 4x correspondiente (a excepción de las muestras para MS-SDS-PAGE que ya quedaron listas para ser sembradas). Los sobrenadantes se sembraron a razón de 40 µg de proteína/calle.
1.7.3 Desarrollo
Todas las electroforesis se realizaron en miniplacas con un equipo BIO-RAD, modelo Mini-Protean III (Inglaterra). Se utilizó el sistema de buffers descripto anteriormente. Las corridas electroforéticas se llevaron a cabo a un voltaje constante de 200 V durante aproximadamente 1,5 h.
1.7.4 SDS-PAGE
Se preparó un gel de poliacrilamida de 1,0 mm de espesor, formado por un gel separador de concentración constante de acrilamida/bisacrilamida (30,8%) 12% p/v y un gel apilador (stacking) en su parte superior (acrilamida 4% p/v). Se utilizó un peine de 10 calles en las cuales se sembraron 20 µl de cada muestra en cada calle y 4 µl del patrón de LMW de proteínas.
1.7.5 NATIVE-PAGE
Para el caso de la electroforesis nativa se preparó un gel de poliacrilamida de 6% p/v, sin el agregado de SDS. Se siguió la misma metodología utilizada para SDS- PAGE.
1.7.6 2D-SDS-PAGE
Para la primera dimensión de esta técnica se preparó un gel de poliacrilamida de 0,75 mm de espesor, con un gel continuo de acrilamida al 12% (p/v) y con un gel apilador de 4% (p/v) de acrilamida. Se utilizó un peine de 10 calles en las cuales se sembraron 15 µl de muestra en cada calle y 4 µl del patrón de LMW de proteínas. Una vez corrido el gel se cortaron las calles y se colocaron en vasos de precipitado de 25 mL que contenían 5 mL de buffer de tratamiento (descripto en el Inciso 1.7.1). Se calentó en baño de agua a 55 ºC durante 30 minutos, agitando y realizando
cambio de buffer cada 10 minutos. La porción de gel tratado se reservó para montarlo en el tope de gel de la segunda dimensión. Para la segunda dimensión se preparó un gel continuo de 1 mm de espesor con iguales proporciones de acrilamida que en la primera dimensión. Se utilizó un peine de una sola calle en la cual se colocó en posición horizontal la porción de gel corrida en la primera dimensión y previamente tratada con el reductor (2-mercaptoetanol); luego se corrió como una electroforesis monodimensional.
1.7.7 MS-SDS-PAGE
Las proteínas se extrajeron con el buffer de muestra sin el agregado de 2- mercaptoetanol durante 2,5 hs a temperatura ambiente. Las muestras fueron calentadas a ebullición durante 3 min (Ribotta y col., 2001). Se centrifugó en microcentrífuga IEC-Centra MP4R (EUA) a 9.350 x g durante 15 min a 4 ºC. El sobrenadante quedó listo para ser sembrado.
Las proteínas extraídas fueron separadas en un gel preparativo (1 mm de espesor) compuesto por un multistacking de 4, 6, 8, 10 y 12% (p/v de poliacrilamida) y un continuo de 14% (p/v) (Figura 1.4). Se utilizó un peine de una calle en la cual se sembraron 250 µl de muestra.
Cada stacking y la porción continua fueron cortados y las proteínas fueron extraídas de cada fracción con el mismo buffer al que se le incorporó 5% de 2- mercaptoetanol durante 48 hs a temperatura ambiente. Las muestras fueron
Figura 1.4. Esquema representativo de una electroforesis multistacking.
ContinStackinuo 14 %g 12 % StackinStacking 10 %g 8 % StackinStacking 6 %g 4 % Extracto proteico ContinStackinuo 14 %g 12 % StackinStacking 10 %g 8 % StackinStacking 6 %g 4 % Extracto proteico
calentadas en baño de agua hirviendo durante 10 min (1ª dimensión). Las proteínas reducidas fueron eluídas de las tiras de gel y analizadas en un gel electroforético de iguales características que el utilizado en SDS-PAGE (2ª dimensión) (Puppo y col., 2005).
1.7.8 Coloración
Los geles fueron fijados y teñidos con Coomasie Brilliant Blue R-250 al 0,192% p/v en agua/metanol/ácido acético (10:10:4) durante 12 h y desteñidos con etanol 25% p/v y ácido acético 10% p/v a temperatura ambiente.
1.7.9 Obtención de las imágenes y análisis de los geles
Las imágenes de las electroforesis fueron digitalizadas con un scanner HP Scanjet 4070 Photosmart (Hewlett Packard, EUA), mientras que el análisis de las masas moleculares se realizó con el programa Sigma-Gel versión 1.0 (Jandel Scientific, EUA).