El espécimen que se ha obtenido del paciente debe marcarse con una identificación única, además de la información demográfica y clínica, de modo que pueda relacionarse para hacer estudios epidemiológicos. En los Apéndices 8, 11 y 12 se incluyen los métodos de estriado para los aislamientos de especímenes de hisopos, métodos de cultivos primarios, mantenimiento y transporte de los aislamientos. Debido a que los aislamientos de N. gonorrhoeae son sumamente susceptible a las condiciones ambientales adversas (como se describe en la Tabla 28 del Apéndice 8), las cepas deben ser incubadas a 35˚C–36,5˚C en una atmósfera húmeda,
enriquecida con CO2. Se deben subcultivar las colonias que parecen ser gonococos
(diplococos gramnegativos con crecimiento en colonias de color entre rosado y café, de 0,5–1 mm de diámetro, véase el Apéndice 8) de un medio de cultivo primario selectivo a un medio de cultivo no selectivo, como agar chocolate GC con 1% de suplemento definido, para obtener un cultivo puro del aislamiento. (Los
especímenes de sitios normalmente estériles, como la conjuntiva, se cultivan en medios no selectivos para aislamiento primario. Es necesario hacer subcultivos para pureza si el examen de la placa muestra que hubo contaminación.) Si el aislamiento subcultivado no es puro, continúe haciendo subcultivos seriados de colonias individuales de diplococos gramnegativos hasta obtener un cultivo puro. Puede hacerse un diagnóstico presuntivo de N. gonorrhoeae originalmente aislada en un medio selectivo por la morfología de las colonias, la observación de diplococos típicos (gramnegativos) en parejas, tétradas o racimos por coloración de Gram o coloración simple con azul de metileno de Loeffler y reacción oxidasa positiva. Un diagnóstico presuntivo de N. gonorrhoeae originalmente aislado en un medio de cultivo no selectivo puede basarse en esas características más una reacción apropiada en por lo menos una prueba suplementaria, bioquímica o enzimática (por ejemplo, reacción de superoxol 4+, véase ¨Pruebas
Suplementarias¨). Un flujograma de las pruebas requeridas para la identificación presuntiva de los aislamientos de sitios con flora normal (por ejemplo,
aislamientos en medios selectivos tales como TMM, ML o GC-Lect) y aislamientos de sitios normalmente estériles (por ejemplo, aislamientos en medios no selectivos, como agar chocolate GC) se presenta en la Figura 19.
Prueba de oxidasa
La prueba de oxidasa utiliza reactivo de Kovac (una solución al 1% (p/vol) de N, N, N’, N’ –tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina)19para detectar la presencia de
citocromo c en la cadena respiratoria de un microorganismo bacteriano; si el reactivo de oxidasa es catalizado, se torna color púrpura. Las especies de Neisseria dan reacción positiva a la oxidasa, y los diplococcos gramnegativos, oxidasa positivos aislados en medios selectivos para gonococos deben identificarse
presuntivamente como N. gonorrhoeae. La preparación del reactivo de oxidasa y los métodos apropiados de control de calidad se incluyen en el Apéndice 2.
Haga la prueba de oxidasa en crecimiento de colonias representativas que se coloreen como diplococos (gramnegativos). Como el reactivo de oxidasa es tóxico para la bacteria, se recomienda realizar la prueba de oxidasa en un hisopo estéril y no directamente en la placa de cultivo, especialmente si solo existen unas pocas colonias sospechosas. Puede usarse papel de filtro en vez de hisopo para esta prueba. No use asa de Nicromo para la prueba de oxidasa, pues puede producirse una reacción positiva falsa. Si se usó un hisopo estéril para hacer la extensión para la coloración de Gram (como se describe en el Apéndice 4), el hisopo puede usarse
19 Algunos laboratorios pueden usar un reactivo diferente, como el reactivo de Gordon y MacLeod (1% [p/vol]
dimetil-ρ- dihidroclorofenilendiamina; “reactivo de dimetil”) para la prueba de oxidasa. El reactivo de dimetil es más estable que el reactivo de tetrametil (reactivo de Kovac), pero la reacción con el reactivo de dimetil es más lenta que con el reactivo de tetrametil. Si el laboratorio usa reactivo de dimetil, se producirá una reacción positiva cuya evidencia se verá por un cambio de color a azul (no a púrpura, como con el reactivo de tetrametil) en el papel de filtro. Con el reactivo de dimetil la reacción positiva tardará de 10 a 30 minutos en
oxidasa-positiva = sospecha de N. gonorrhoeae
FIGURA 19: Diagrama de flujo de las pruebas para aislamiento e identificación presuntiva de cepas de Neisseria gonorrhoeae
Las colonias en medios selectivos (Ej., Martin- Lewis [ML] o Thayer-Martin Modificado MTM]) son rosadas-marrón y traslúcidas, con consistencia
lisa y márgenes definidos, y típicamente de 0,5 – 1,0 mm de diámetro.*
Las colonias sobre agar GC-chocolate son rosadas-marrón y traslúcidas, con consistencia lisa y márgenes definidos, y típicamente de 0,5 – 1,0 mm de
diámetro.* Muestras de sitios estériles
(Ej., conjuntiva) Muestras de sitios no estériles
(Ej., uretra, cérvix, vagina, recto y faringe)
* Si un aislamiento presuntivo presenta características inusuales en las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos, confirme la identificación con pruebas bioquímicas y enzimáticas.
Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos sobre medio
de prueba GC * Cepas fastidiosas de N. gonorrhoeae pueden producir
pequeñas colonias, como punticos, de ~0,25-mm
(Si el aislamiento primario fue sobre medio no selectivo)
* Cepas fastidiosas de N. gonorrhoeae pueden producir pequeñas colonias, como punticos, de ~o,25-mm
Otra morfología = negativo (Gramnegativo)
diplococos de forma de frijol = sospecha de N. gonorrhoeae
oxidasa-negativa = negativo
• Un aislamiento de un medio selectivo (MTM, ML) es considerado ‘presunto GC’ cuando es un diplococo oxidasa-positivo (gramnegativo). • Un aislamiento de un medio no selectivo puede
ser considerado presunto GC cuando es un diplococo oxidasa-positivo (gramnegativo) y da una reacción apropiada en al menos una prueba suplementaria (ej., reacción superoxol 4+). Nota: Es una práctica aceptable realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos con aislamientos presuntivos de N. gonorrhoeae (GC) con fines de tratamiento.*
Prueba de oxidasa
Reacciones típicas de N. gonorrhoeae en pruebas suplementarias: Superoxol/Catalasa: positiva Resistencia al Colistin: positiva
(resistente)
Reducción de nitrato: negativa Producción de polisacárido: negativa Producción de ácido: solo ácido a
partir de glucosa
Substrato-enzima: hidroxiprolil- aminopeptidasa + Coloración de Gram o coloración simple
para conducir la prueba de oxidasa. La prueba de oxidasa solo debe realizarse con microorganismos de crecimiento fresco (18–24 horas).
• Método del hisopo para la prueba de oxidasa de Kovac
a) Seleccione las colonias sospechosas de la placa de cultivo (medio selectivo o no selectivo) con el hisopo.
b) Añada una gota de reactivo de oxidasa al hisopo usando una pipeta de Pasteur.
c) Si el aislamiento es N. gonorrhoeae, se producirá una reacción positiva (púrpura) en 10 segundos19(véase la Figura 20).
• Método del papel de filtro humedecido para la prueba de oxidasa de Kovac a) Coloque una pieza de papel de filtro en una placa de Petri.
b) Justo antes de hacer la prueba, añada una o dos gotas de reactivo de oxidasa al papel de filtro, y deje que el papel lo absorba; el papel de filtro deberá estar húmedo, pero no mojado, después de que el reactivo ha sido absorbido. c) Tome una parte de la colonia seleccionada para la prueba usando un asa de
platino, un asa plástica, un hisopo estéril o un aplicador de madera y frótela en el papel de filtro humedecido. (No use asa de Nicromo.) Si el aislamiento es N. gonorrhoeae, debe ocurrir una reacción positiva (púrpura) en 10 segundos19(véase la Figura 10.)
FIGURA 20: Prueba de oxidasa de Kovac: una reacción positiva en un hisopo de Neisseria gonorrhoeae
La foto de la derecha muestra una reacción positiva en un hisopo que fue usado para obtener un crecimiento sospechoso y humedecido luego con reactivo de oxidasa de Kovac.La foto de la izquierda muestra un resultado positivo de la prueba de oxidasa de Kovac directa en placa.Note que si el crecimiento es ralo, se sugiere que el laboratorio no utilice el método de prueba en placa directa porque es tóxico para el crecimiento del gonococo.