Figura 20 Cuantificación de isoprenoides en el mutante ggpps11‐4 Se crecieron plántulas silvestres (WT)
2. Se han identificado tres fenotipos distintos en mutantes del gen
GGPPS11.
En este trabajo doctoral se han identificado y caracterizado tres mutantes de pérdida de función de GGPPS11 de la colección SALK, los alelos ggpps11‐2 (SALK_015098), ggpps11‐3 (SALK_085914) y ggpps11‐4 (SALK_14061), respetando la nomenclatura establecida
recientemente en el trabajo de (Ruppel et al., 2013) donde se ha identificado un cuarto alelo al que han denominado ggpps11‐1. Como hemos mostrado, el fenotipo de los tres alelos es muy diferente. Mientras que ggpps11‐2 y ggpps11‐3 son dos alelos letales, las plantas ggpps11‐4, al igual que las ggpps11‐1, son viables. Sin embargo, se han detectado diferencias importantes entre los dos alelos letales y los dos viables. El alelo ggpps11‐3 tiene un fenotipo de letalidad embrionaria (Figura 13), mientras que el alelo ggpps11‐2 germina pero es albino e incapaz de desarrollarse más allá del estadio de plántula (Figura 11). Por su parte, los alelos viables son capaces de desarrollarse normalmente pero son más pequeños que los individuos silvestres y tienen defectos de pigmentación. El alelo ggpps11‐1 presenta un fenotipo variegado con sectores totalmente albinos (Ruppel et al., 2013) mientras que las plantas ggpps11‐4 son pálidas pero no variegadas (Figura 19).
Para entender estas diferencias fenotípicas, en primer lugar se comprobó que los fenotipos observados sólo se debían a la disrupción del gen GGPPS11 mediante el genotipado de al menos 25 plantas por línea mutante y en segundo lugar se analizó la posición concreta del T‐DNA por secuenciación. En el alelo pálido ggpps11‐4 la inserción ocurrió en la región 5’ no traducida (5’UTR) lo que podría justificar las diferencias fenotípicas tan grandes con los dos alelos letales, donde la disrupción ocurrió dentro de la secuencia codificante (Figura 10A). Por su parte, el alelo ggpps11‐1 presenta una mutación puntual de un nucleótido que provoca un cambio de un aminoácido situado entre el FARM y dos argininas conservadas (Figura 10A), ambos motivos esenciales en la determinación de la cavidad catalítica de las trans‐ preniltransferasas (Tarshis et al., 1996; Wang y Ohnuma, 1999). La sustitución de un residuo de ácido aspártico también conservado en la mayoría de las isoformas de la familia por una asparagina interfiere quizás en la estructura tridimensional de la proteína y por tanto en la cavidad catalítica disminuyendo la actividad GGPPS a pesar de que la expresión génica no varíe (Ruppel et al., 2013). La primera conclusión que se podría sacar a partir del estudio de estos alelos es que la actividad GGPPS11 es la más importante de la familia GGPPS en Arabidopsis, como ya sugerían los datos de expresión génica (Figura 9A). Además se confirma que no hay redundancia génica entre al menos este parálogo y el resto puesto que la actividad de las isoformas restantes no puede rescatar la pérdida de función de GGPPS11. En este sentido y haciendo referencia a su patrón de expresión, este resultado era quizás esperable puesto que el del resto de parálogos que codifican isoformas plastídicas está muy restringido siendo muy poco importante en tejido fotosintético. Por tanto aunque se indujeran en el mutante, no podrían quizás paliar la pérdida de función GGPPS11 que es ubicua. Para deducir el papel de GGPPS11 en la síntesis de isoprenoides plastídicos a partir de los fenotipos de los alelos mutantes es necesario conocer qué fenotipos genera el bloqueo en la producción de grupos específicos de estos metabolitos. Como se ha comentado anteriormente, se ha propuesto que la prenilación de proteínas en el citosol puede llevarse a cabo con precursores (GGPP) provenientes de los plastos (Gerber et al., 2009). La falta de actividad de las enzimas responsables de la prenilación de proteínas no es letal. El estudio de sus mutantes parece indicar que este tipo de modificación post‐traduccional parece estar afectando a la regulación negativa de ABA y GAs, al control de la proliferación celular en los meristemos apical y floral y a la morfogénesis (Crowell y Huizinga, 2009; Hála et al., 2010)
pero el fenotipo de estas plantas no impide su viabilidad. Los mutantes deficientes en giberelinas son enanos, con hojas verdes más oscuras y tienen la floración retardada (Koornneef y van der Veen, 1980). La falta de tocoferoles tampoco es letal. Por ejemplo el mutante vte2, que carece de tocoferoles y de sus precursores, sufre defectos severos en el crecimiento durante las primeras etapas de desarrollo de plántula y sus semillas tienen una longevidad reducida como consecuencia de una peroxidación de lípidos acentuada (Sattler et al., 2004). Sin embargo los mutantes deficientes en la biosíntesis de filoquinona, transportador de electrones del PSI esencial en la fotosíntesis, muestran un fenotipo más severo, no son autotróficos y presentan letalidad a nivel de plántula (Gross et al., 2006; Shimada et al., 2005; Lohmann et al., 2006). La ausencia de filoquinona afecta a la estabilidad y funcionalidad del PSI y ésta a su vez a la del PSII (incluso en los niveles de plastoquinonas, que también se reducen) lo que se traduce en una fotosíntesis defectuosa que causa el fenotipo tan acusado. Todos los mutantes de la ruta biosintética sin embargo producen y acumulan clorofilas, aunque en menor nivel que las plantas silvestres. La única excepción es la del mutante aae14‐1, deficiente en la actividad MenE, que es albino (Kim et al., 2008).
Fenotipos albinos como el observado en el mutante ggpps11‐2 también se han detectado en líneas deficientes en la producción de plastoquinonas o carotenoides. El bloqueo de la actividad de las enzimas involucradas en la biosíntesis de plastoquinonas genera un fenotipo albino (Norris et al., 1995, 1998; Cheng et al., 2003; Motohashi et al., 2003; Block et al., 2013). Sin embargo, y como acabamos de comentar, mutantes deficientes en la síntesis de filoquinonas como abc4 (donde la actividad MenA está bloqueada) presentan niveles muy bajos de plastoquinonas (3% de los niveles silvestres) y aun así son verdes y capaces de desarrollarse hasta el estadio de plántula (Shimada et al., 2005). Las plastoquinonas actúan como transportadores de electrones en el PSII pero además se ha descrito que participan en la síntesis de carotenoides. En concreto, son responsables de la transferencia de electrones en la reacción de desaturación del fitoeno para dar ζ‐caroteno (Norris et al., 1995), paso controlado por la actividad PDS (Figura 5). La falta de actividad PDS también genera el mismo fenotipo albino (Qin et al., 2007) por lo que se puede razonar que es la deficiencia de carotenoides y no de plastoquinonas la responsable del fenotipo letal. De la misma manera, otros mutantes deficientes en la síntesis de carotenoides como psy (Figura 12B), spc1‐2 (actividad ZDS) (Dong et al., 2007) y el mutante cuádruple de las hidroxilasas BCH1, BCH2, CYP97A3 y CYP97C1 (Kim et al., 2009) tienen un fenotipo albino. La mutación de algunos genes que codifican enzimas de la biosíntesis de clorofilas también genera este fenotipo. En otros casos los mutantes son pálidos (como consecuencia de una menor síntesis de estos pigmentos), crecen más lento y también presentan defectos en el desarrollo de los cloroplastos como consecuencia de la deficiencia del PSI y PSII (Tanaka et al., 2011). Es importante destacar que la biosíntesis de clorofilas y carotenoides está ligada en plantas expuestas a la luz, y que su ausencia provoca el bloqueo de la biogénesis de los cloroplastos y por tanto el fenotipo más severo. Por el contrario, el bloqueo de la síntesis de carotenoides con norflurazón, un inhibidor de la enzima PDS, genera plantas albinas que acumulan tocoferoles y plastoquinonas (Norris et al., 1995), lo que indica que la síntesis de estos isoprenoides plastídicos no está ligada a la de los carotenoides.
Con todos estos datos es fácil razonar y entender por qué los mutantes de la vía del MEP, que produce los precursores de todos los isoprenoides plastídicos, también son albinos
(Myel et al., 1996; Estévez et al., 2000; Xing et al., 2010; Hsieh et al., 2008; Hsieh y Goodman, 2006; Gutiérrez‐Nava et al., 2004; Hsieh y Goodman, 2005). Sin embargo, es difícil deducir a partir del fenotipo albino del alelo ggpps11‐2 o del pálido del alelo ggpps11‐4 si GGPPS11 está implicada en la producción de GGPP para grupos específicos de isoprenoides plastídicos (carotenoides, clorofilas, plastoquinonas) o para varios de estos grupos. No obstante, aunque el mutante ggpps11‐2 tiene un fenotipo visual indistinguible del de los mutantes deficientes en la ruta del MEP (como cla1) o únicamente en la síntesis de carotenoides (como psy), a nivel de metabolitos sí se detectaron diferencias. Todos los mutantes acumularon niveles bajísimos de pigmentos fotosintéticos (como se esperaba), pero estos niveles variaban entre las distintas líneas. La cantidad de carotenoides y clorofilas cuantificados en el mutante ggpps11‐
2 fueron similares a los de cla1 pero mayores a los del mutante psy (Figura 12C). Esto podría
ser debido a que una cierta cantidad de prenil difosfatos derivados de la ruta del MVA puedan importarse al plasto y servir para la síntesis de carotenoides y clorofilas en los mutantes
ggpps11‐2 y cla1, aunque parece ser que el transporte de GGPP no es tan eficiente (Bick y
Lange, 2003; Flügge y Gao, 2005).
Para concluir este apartado podemos afirmar que la gran variedad fenotípica de los distintos alelos sugiere que la función GGPPS11 sea bastante compleja. En el cloroplasto, la actividad GGPPS11 es esencial y está relacionada con la biosíntesis de carotenoides y clorofilas puesto que su deficiencia genera un fenotipo albino. Por tanto los criterios que se establecieron al principio de este trabajo doctoral para elegir una isoforma potencialmente relacionada con la carotenogénesis fueron correctos. Sin embargo, el estudio del mutante
ggpps11‐2 no permite averiguar si la actividad GGPPS11 está involucrada a su vez con la
producción de ningún otro isoprenoide plastídico.