Influencia de los tratamientos de preparación para los ensayos biológicos

El silicio poroso, especialmente el SPn, tiene una elevada reactividad superficial,

por lo que es de gran interés conocer la influencia que tendrán en sus propiedades los diversos tratamientos de esterilización y limpieza, necesarios para su evaluación en los distintos ensayos biológicos realizados en el capítulo 6.

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Dos de los métodos más comunes y sencillos para la esterilización de los materiales son la inmersión en etanol (EtOH) y la irradiación con luz ultravioleta (UV). Como se explicó en el capítulo 1, la luz UV transforma los grupos amino (NH2), que

son los grupos depositados mediante las diversas técnicas de funcionalización, en grupos hidroxilo (OH), por lo que a lo largo de este trabajo, se ha empleado el EtOH como método de esterilización. Por otra parte, la limpieza de los sustratos en los ensayos biológicos se ha realizado empleando una solución salina con tampón de fosfato (PBS, apartado 2.4.6). Para estudiar cómo afectan estos tratamientos de esterilización y limpieza a las propiedades del SPn, los sustratos se han sumergido en

EtOH y PBS durante un periodo de 432 horas, y se ha evaluado la variación de la composición superficial y de la fotoluminiscencia a lo largo de dicho intervalo, tomando como referencia la variación experimentada por sustratos de SPn expuestos a la

atmósfera y por sustratos conservados en una cámara seca. A partir de los espectros de FTIR se ha estudiado la evolución de la banda de absorción situada alrededor de 2100 cm-1, correspondiente a los enlaces SiHx. Se ha escogido esta banda porque el fondo es

muy plano en la zona del espectro en la que aparece y porque su análisis permite conocer simultáneamente el comportamiento de los tres tipos de enlace SiHx: SiH, SiH2

y SiH3. Los resultados obtenidos para los grupos SiH2 en esta banda se han comparado

con los resultados obtenidos para los mismos grupos en la banda centrada en 906 cm-1, observándose el mismo comportamiento. Otras bandas relevantes son las asociadas a la aparición de óxidos: enlaces SiH tras oxidar, cuya banda asociada aparece en 2250 cm-1, óxido de silicio, cuya banda aparece en 1070 cm-1 y las bandas asociadas a la formación de grupos hidroxilo OH, que aparecen alrededor de 3650 cm-1 y en el rango 850-910 cm-1. En los espectros de fotoluminiscencia se ha evaluado la variación de la intensidad y la posición del máximo de emisión, así como la de la anchura a media altura.

Para estudiar la evolución de las propiedades de los sustratos de SPn conservados

en las condiciones anteriores, los espectros de FTIR y fotoluminiscencia de los distintos sustratos se han medido en los siguientes intervalos: 3, 24, 48, 72, 144 y 432 horas. El SPn empleado en este estudio se ha obtenido tras 180 s de ataque electroquímico.

3.3.1. Composición química.

La evolución con el tiempo de los espectros de infrarrojo correspondientes a los sustratos de SPn conservados en los distintos ambientes se muestra en las figuras 3.9-

3.12. En todos los casos, los espectros están referenciados a la oblea de silicio monocristalino correspondiente.

Figura 3.9: Evolución temporal de los espectros FTIR de las muestras silicio nanoestructurado expuestas a la atmósfera.

Figura 3.10: Evolución temporal de los espectros FTIR de las muestras silicio nanoestructurado conservadas en cámara seca.

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Figura 3.11: Evolución temporal de los espectros FTIR de las muestras silicio nanoestructurado conservadas en EtOH.

Figura 3.12: Evolución temporal de los espectros FTIR de las muestras silicio nanoestructurado conservadas en PBS.

En los cuatro casos, es decir, SPn expuesto a la atmósfera (figura 3.9),

conservado en cámara seca (figura 3.10), en EtOH (figura 3.11) y en PBS (figura 3.12), la banda de absorción correspondiente a enlaces SiHx disminuye con el paso del tiempo,

como se observa en la figura 3.13, en la que se muestra la evolución temporal del área bajo la curva asociada a la banda de absorción de dichos enlaces (2100 cm-1). Sin embargo, mientras que la variación producida en los tres primeros casos es de entre el 62 y el 67 % del valor inicial transcurridas 432 horas, la disminución producida en los sustratos conservados en PBS es mucho más acusada, siendo un 60% del valor inicial transcurridas las primeras 24 horas y llegando a ser tan sólo un 1% del valor inicial al cabo de 432 horas. Es interesante destacar que estas últimas muestras son las que sufren mayor oxidación, como se verá a continuación.

SiHx 0 50 100 150 200 3 24 48 72 144 432 Tiempo (horas) Are a ( % ) Aire seco EtOH PBS

Figura 3.13: Evolución temporal de los enlaces SiHx para las muestras de silicio nanoestructurado

conservadas en diferentes atmósferas.

La aparición de nuevas componentes a lo largo del tiempo es distinta en los diferentes casos. En las muestras de referencia, es decir, las muestras expuestas a la atmósfera y las conservadas en cámara seca, se mantienen las mismas contribuciones que las obtenidas en el espectro inicial. Tan sólo tras 432 horas aparece una componente asociada a óxidos de silicio, aunque con una intensidad casi despreciable. En particular, para las muestras conservadas en aire (figura 3.9), dicha banda de absorción está centrada en 1060 cm-1, con un área total bajo la curva, de 40 unidades arbitrarias (ua), y se puede descomponer en dos contribuciones, 1035 y 1070 cm-1, que corresponden a Si- O en estructuras del tipo Si-O-Si y a SiO2, respectivamente. En las muestras

conservadas en cámara seca (figura 3.10), el área total bajo la curva es 9 ua, bastante menor que en las muestras conservadas en aire, como cabía esperar al estar menos

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expuestas a vapor de agua, y la contribución tiene tres componentes: 1022 cm-1 (Si-O- Si), 1070 cm-1 (SiO2) y en 1108 cm-1 (Si-O-C).

En las muestras conservadas en EtOH (figura 3.11) la banda asociada a enlaces Si-O (centrada en 1100 cm-1) aparece trascurridas tan sólo 24 horas. Como en el caso de los sustratos conservados en la cámara seca, dicha banda se puede descomponer en tres contribuciones: 1033 cm-1 (Si-O-Si), 1069 cm-1 (SiO2) y 1103 cm-1 (Si-O-C). Tras 72

horas aparecen bandas de absorción correspondientes a enlaces SiH tras oxidar (2250 cm-1) y a CHx de cadenas hidrocarburadas procedentes del EtOH (2920 cm-1). La tabla

3.1 muestra la evolución del área bajo la curva asociada a cada una de estas contribuciones. La banda asociada a la oxidación del silicio aumenta a lo largo del tiempo, siendo al final del estudio casi 6 veces mayor que la banda de las muestras expuestas a la atmósfera. El área bajo la curva correspondiente a la banda de absorción de las cadenas hidrocarbonadas es prácticamente despreciable frente a la anterior.

A (ua) 3 h 24 h 48 h 72 h 144 h 432 h

SiO - 23 15 27 66 224

SiH tras oxidar - - - 4

CHx - 0,6 0,5 3 5 5

Tabla 3.1: Evolución temporal del área bajo la curva de las bandas de absorción de FTIR de los sustratos de silicio nanoestructurado conservados en EtOH.

Finalmente, las muestras sumergidas en PBS (figura 3.12) presentan la banda de absorción correspondiente a la oxidación del silicio de mayor intensidad. De hecho, el grado de oxidación de los sustratos sumergidos en PBS durante 48 horas es superior al experimentado por los sustratos sumergidos en EtOH a lo largo de las 432 horas del estudio. La contribución asociada a SiH tras oxidar (2250 cm-1) aparece transcurridas tan sólo 24 horas y además surgen nuevas bandas de absorción correspondientes a SiOH y SiCH3. La evolución de los picos y de las áreas, se muestran en la tabla 3.2.

Área (ua) 3 h 24 h 48 h 72 h 144 h 432 h

SiO - 75 502 651 711 766

SiH tras oxidar - - 3 9 14 19

SiOH(887) - - 10 16 19 29

SiCH₃(857) - - 1 93 109 42

Tabla 3.2: Evolución temporal del área bajo la curva de las bandas de absorción de FTIR de los sustratos de silicio nanoestructurado conservados en PBS.

Por lo tanto, la esterilización con EtOH y los lavados con PBS modifican la composición química de los sustratos de silicio poroso respecto a los que han sido expuestos a la atmósfera y conservados en cámara seca. Dicha modificación se traduce en una mayor oxidación así como en la aparición de nuevas componentes: CHx, en el

caso de los sustratos sumergidos en EtOH, y de las componentes SiOH y SiCH3, en los

sustratos sumergidos en PBS. No obstante, la variación que se produce en los sustratos sumergidos en EtOH es comparable a la de los sustratos de referencia dentro de las primeras 24 horas. En el caso de los sustratos sumergidos en PBS, es interesante destacar que se forman estructuras SiOH, cuando el porcentaje de SiHx es todavía

significativo. En particular, la contribución asociada a grupos OH es bastante relevante tras 48 horas, conservando el 50 % de las estructuras SiHx presentes, efecto interesante

para la funcionalización por silanización [10].

3.3.2. Fololuminiscencia.

La evolución temporal de los espectros de fotoluminiscencia correspondientes a los sustratos de SPn expuestos a la atmósfera y conservados en cámara seca y en EtOH

es muy similar, mientras que los espectros correspondientes a los sustratos conservados en PBS presentan mayores diferencias. La figura 3.14 muestra la evolución temporal de los espectros de fotoluminiscencia obtenidos para los sustratos conservados en EtOH (A) y PBS (B). La intensidad de fotoluminiscencia disminuye con el tiempo y la posición del máximo varía ligeramente en los espectros correspondientes a los sustratos conservados en EtOH, mientras que en los conservados en PBS, la emisión inicial desaparece tras 24 horas y aparece un nuevo máximo a longitud de onda menor. La variación de la intensidad con el tiempo se muestra en la figura 3.15 para los cuatro casos estudiados.

En los sustratos de referencia (atmósfera y cámara seca) y en los sustratos sumergidos en EtOH, se observa una disminución de la intensidad del pico de fotoluminiscencia con el tiempo. La disminución de la intensidad en las muestras expuestas al aire y en cámara seca es del 64% en las primeras 24 horas y del 30% transcurridas 432 horas. La disminución de la intensidad observada en los sustratos sumergidos en EtOH es comparable a la observada en los sustratos de referencia en las primeras 24 horas, aunque es bastante más acusada a partir de 72 horas, siendo la intensidad tan sólo un 9 % de la inicial transcurridas las 432 horas del estudio. Por el

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contrario, la intensidad del máximo de fotoluminiscencia registrada para los sustratos de SPn conservados en PBS muestra una importante disminución en las primeras 24 horas

mientras que en las sucesivas se produce un ligero aumento de la intensidad, como consecuencia de la aparición de una nueva banda de fotoluminiscencia centrada en 498 nm.

Figura 3.14: Evolución temporal de los espectros de fotoluminiscencia correspondientes a sustratos de silicio nanoestructurado expuestos a EtOH (A) y PBS (B).

B A

Figura 3.15: Evolución temporal de la intensidad de emisión de fotoluminiscencia de los sustratos de silicio nanoestructurado expuestos a la atmósfera, conservados en cámara seca, en EtOH y en PBS.

La figura 3.16 muestra la evolución temporal de la posición del máximo de fotoluminiscencia. Los sustratos expuestos a EtOH y los conservados en la cámara seca presentan un comportamiento similar, manteniéndose la posición del máximo de fotoluminiscencia prácticamente constante alrededor de 652 nm (1.9 eV). En ambos casos, la anchura a media altura aumenta desde 97 nm hasta 119 nm, es decir, aumenta la dispersión del tamaño de los nanocristales como consecuencia de la oxidación que sufren. Sin embargo, en las muestras expuestas al aire la posición del máximo disminuye ligeramente, desde 700 nm (1.8 eV) a 622 nm.(2.0 eV).

Los espectros correspondientes a las muestras conservadas en PBS presentan un desplazamiento del máximo de fotoluminiscencia desde 652 nm (1.9 eV) hasta 497 nm (2.5 eV), en tan sólo 24 horas, una intensidad creciente con el tiempo de inmersión en PBS y una anchura a media altura de 60 nm frente a los 100 nm que presenta inicialmente. Todo esto se debe a que tras un sólo día de inmersión en PBS, la fotoluminiscencia en el visible desaparece y comienza a observarse una nueva banda de emisión, cercana al ultra-violeta. Esta banda, llamada banda de fotoluminiscencia en el

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azul-verde, se observa en muestras que han sido expuestas a algún tipo de tratamiento de oxidación. Aunque el origen de esta banda es aún fuente de controversia, una de las teorías propuestas es la presencia de grupos silanoles, como centros responsables de la emisión en azul [11, 12]. Es interesante destacar que los espectros de FTIR mostraban la formación de grupos SiOH solamente en las muestras sumergidas en PBS (figura 3.12) y que el área bajo la curva correspondiente aumenta con el tiempo de conservación en PBS, del mismo modo que la intensidad de fotoluminiscencia. Esta banda de emisión en el azul, está asociada a desexcitaciones del orden de los nanosegundos, por lo que su estudio es interesante para aplicaciones en displays y dispositivos optoelectrónicos de alta velocidad. Sin embargo, la relevancia de este comportamiento en relación a los estudios realizados en este trabajo, es que la emisión de fotoluminiscencia en el azul-verde coincide con la emisión de fluorescencia del isotiocianato de fluoresceína (FITC, apartado 2.4.6), el fluoroforo que se ha empleado de forma sistemática en este trabajo para evaluar la reactividad de los grupos amino superficiales y cuyo máximo de emisión está en 510 nm. Este fenómeno puede falsear las imágenes de fluorescencia, al dar como resultado emisión que proviene de la fotoluminiscencia del SPn en lugar de la fluorescencia de la FITC.

Figura 3.16: Evolución temporal de la posición del máximo de fotoluminiscencia de los sustratos de silicio nanoestructurado conservados en distintos medios.

Para evaluar la posible interferencia de la banda de fotoluminiscencia centrada en 498 nm con las observaciones realizadas mediante el microscopio de fluorescencia (apartado 2.4.6) se ha realizado el siguiente estudio: por un lado, sustratos de SPn recién

fabricados se han sumergido en PBS durante 24, 96 y 216 horas. De forma paralela, sustratos de SPn expuestos a la atmósfera durante los mismos tiempos (24, 96 y 216

horas), se han sumergido a continuación en PBS durante 1 día. En todos ellos, se ha estudiado la emisión en el verde-azul empleando el microscopio de fluorescencia, con las siguientes condiciones de medida: escala de verde (25-100) y tiempo de exposición 2 segundos. En la figura 3.17 se muestra la emisión recogida para un sustrato de SPn

sumergido en PBS, inmediatamente después de su formación, durante 24 horas. En efecto, las imágenes obtenidas con el microscopio de fluorescencia recogen una emisión análoga a la que cabría esperar en sustratos a los que se hubieran enlazado moléculas de FITC previamente.

Figura 3.17: Imagen de fluorescencia correspondiente a una muestra de silicio nanoestructurado sumergida en PBS durante 24 horas inmediatamente después del ataque electroquímico.

Figura 3.18: Imagen de fluorescencia correspondiente a una muestra de silicio nanoestructurado envejecida durante 6 días sumergida en PBS durante un día.

Al aumentar el tiempo de inmersión en PBS a 24, 96 y 216 horas, las imágenes de fluorescencia muestran una emisión creciente, de acuerdo con el comportamiento de

SPn

Si

Si

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la intensidad de fotoluminiscencia observada anteriormente (figuras 3.14B y 3.15). Este aumento se explica a su vez por el aumento de silanoles observado por FTIR (tabla 3.6). Por el contrario, los sustratos de SPn que se sumergieron en PBS varios días después de

haber sido preparados no muestran emisión en el verde (figura 3.18).

Como consecuencia de las observaciones anteriores se deduce que para el empleo de sustratos de SPn en ensayos que requieran la inmersión en PBS durante un

cierto tiempo y la posterior detección por fluorescencia empleando FITC, se ha de tomar la precaución de dejarlos expuestos a la atmósfera, como mínimo 24 horas, antes de sumergirlos en PBS o bien, emplear protocolos específicos para la eliminación de la autofluorescencia de los materiales (ver sección 2.3.6).