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CAPITULO II: La Ceramida induce la muerte de los fotorreceptores de retina mediante la

5. Inmunocitoquímica

Después de los diferentes tratamientos, los cultivos se fijaron con PF al 2% en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos o con Metanol frío por 15 minutos a -20°C, seguido por permeabilización con Tritón x-100 al 0,1% durante 15 o 7 minutos según la fijación hubiera sido realizada con PF o en metanol, respectivamente. Posteriormente, se procedió al bloqueo de los sitios no específicos de reconocimiento de los anticuerpos, incubando durante 1 hora a temperatura ambiente con Leche descremada al 2% en Buffer TNT (100mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl y 0,1% tween 20). A continuación, se llevaron a cabo distintas inmunomarcaciones, como se describirá a continuación.

5.1 Identificación Neuronal

Los FR se identificaron mediante expresión del Cone Rod Homeobox (Crx). El Crx es un factor de trascripción que se expresa tan pronto como los progenitores neuronales de la retina inician su proceso de diferenciación hacia FR (Garelli et al., 2006). Cultivos previamente fijados en PF fueron incubados toda la noche con una solución 1:600 en PBS de anticuerpo policlonal anti-CRX. Luego de tres lavados con PBS, se agregó una dilución (1:200) de anticuerpo secundario Cy3 anti-conejo durante 1 hora a temperatura ambiente.

Para la identificación de las neuronas amacrinas, se recurrió al reconocimiento de la proteína de membrana sintaxina-1, expresada selectivamente por este tipo neuronal (Akagawa and Barnstable 1986). Se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-sintaxina, HPC-1, (Sigma #S0664) en una dilución (1:100) durante 2 h a temperatura ambiente seguido por incubación con anti cuerpo secundario cy2 anti-ratón (1:200) 1 hora a temperatura ambiente.

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Las muestras se analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 2000). La proporción entre neuronas fotorreceptoras y amacrinas en nuestros cultivos neuronales de retina es aproximadamente 70:30, respectivamente.

5.2 Caspasa-3-clivada

La caspasa-3 es una proteína miembro de la familia de las Cisteinil-Aspartato Proteasas (Caspasas). La activación secuencial de las caspasas, juega un rol central en la ejecución de la muerte programada por apoptosis. La caspasa-3 forma parte de las llamadas caspasas efectoras, cuya activación contribuye al desmantelamiento celular. En condiciones basales, esta caspasa se mantiene inactiva en el citoplasma. Frente a diversos estímulos apoptóticos, se activan mediante clivaje, proceso que es ejecutado por una caspasa activadora (Fernandes-Alnemri et al., 1994).

Los cultivos previamente fijados con PF y permeabilizados, fueron incubados con una dilución 1:200 de anticuerpo anti-caspasa-3-clivada (Cell Signaling #9661), forma activa de la caspasa-3, durante toda una noche a 4°C en cámara húmeda. Luego, las células fueron lavadas con PBS e incubadas con un anticuerpo Cy3 anti-conejo en una dilución 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente.

5.4 Translocación nuclear de AIF

El Factor Inductor de la Apoptosis (AIF, por sus siglas en inglés) es una flavoproteina de localización mitocondrial con actividad NADH oxidasa y codificada por un gen nuclear (Susin et al. 1999). Frente a diversos estímulos apoptóticos el AIF es liberado desde la mitocondria hacia el citosol y desde allí se transloca al núcleo (Penninger and Kroemer 2003). Una vez en el núcleo, AIF es responsable de la condensación de la cromatina y de la fragmentación a gran escala del ADN (aprox. 50 kb) a través de un mecanismo caspasa-independiente (Lorenzo et al., 1999).

Cultivos fijados en metanol fueron incubados con una dilución 1:30 de anticuerpo anti- AIF (Santa Cruz #sc-13166) durante toda una noche a 4°C en cámara húmeda. Luego de lavar el anticuerpo con PBS, las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario Cy2 anti-ratón, en una dilución 1:200. Para visualizar los núcleos, se marcaron con TOPRO-3, en una concentración de 2 µM, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron por microscopia láser confocal, utilizando un microscopio confocal DMIRE2/TSCSP2 (Leica, Alemania) equipado con un objetivo 63X de inmersión acuosa. Las imágenes fueron adquiridas mediante el software de procesamiento del equipo (LCS software, Leica).

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5.4 Inmunomarcación de PAR

Los polímeros de ADP-ribosa (PAR) son rápidamente sintetizados por acción catalítica de las Poli-ADP-Ribosa Polimerasas (familia de proteínas PARP), en respuesta a un daño sobre el ADN. Las PARP contienen dedos de Zinc de unión al ADN, que las hace capaces de detectar sitios de corte de esta molécula. Esto genera un cambio conformacional que activa a la polimerasa (Ikejima et al. 1990). La acción de la PARP da lugar a la formación de polímeros de PAR que se unen a otras proteínas y las activan (modificación postraduccional), entre las cuales se encuentran ADN polimerasas, ADN ligasas y topoisomerasas implicadas en el proceso de reparación del ADN (Smulson et al. 2000).

Cultivos previamente fijados en PF y permeabilizados, se bloquearon con leche al 2% en buffer TNT durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó una dilución 1:50 de anti-PAR (Enzo # ALX-804-220) y se incubó a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo Cy2 anti-ratón (1:200) durante 1 hora a temperatura ambiente. Al finalizar la incubación, las células se lavaron 3 veces con Tritón x-100 al 0,1% en PBS (PBST) y finalmente se montaron sobre portaobjeto para su análisis.

La Tabla III resume los anticuerpos utilizados en las diferentes inmunocitoquímicas

Tabla III. Anticuerpos utilizados en inmunocitoquímica.

Anticuerpo Reconoce Origen Fluoróforo

asociado Fuente Dilución de uso Tiempo de incubación CRX Neuronas fotorreceptoras conejo --- Cedido por Dr. Cheryl Craft (University of Southern California) 1:600 Toda la noche

HPC-1 Neuronas amacrinas ratón --- Sigma #S0664 1:200 2 h

Anti caspasa-3

clivada Caspasa 3-clivada conejo --- Cell Signaling #9661 1:200 2 h

Anti-AIF AIF ratón --- Santa Cruz #sc-

13166 1:30

Toda la noche

Anti-PAR Proteínas PAR-iladas ratón --- Enzo # ALX-804-220 1:50 Toda la

noche

Cy2 anti-mouse Inmunoglobulinas de

ratón cabra Cy2

Jackson

ImmunoResearch 1:200 1 hora

Cy3 anti-rabbit Inmunoglobulinas de

conejo cabra Cy3

Jackson

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