Inmunosensores en flujo

Los inmunosensores en flujo se enmarcan dentro del grupo de sensores hidrodinámicos, donde en general el sistema de detección está desplazado del lugar donde se produce la interacción Ab-Ag. El producto a detectar es impulsado hasta el detector con ayuda de un fluido.

Este grupo de sistemas está basado principalmente en la técnica de Análisis por Inyección en Flujo (FIA, Flow Injection Analysis), dando lugar al desarrollo de

Inmunoensayos en flujo (FIIA, Flow Injection Immunoassay). Dichos ensayos surgen

en 1980 a partir del trabajo publicado por Lim y Miller (141).

Los inmunoensayos por inyección en flujo permiten el análisis automático de un gran número de muestras y/o medidas continuas. Este método ha demostrado ser muy eficaz en una amplia variedad de problemas analíticos. Las ventajas de la especificidad inherente de las reacciones inmunoquímicas han sido incorporadas a las técnicas en flujo, mostrándose como un poderoso instrumento para el desarrollo de protocolos analíticos, mejorando la velocidad y calidad del inmunoensayo convencional. Este tipo de sistemas de análisis tienen una sensibilidad y selectividad similares a las de otros inmunoensayos, pero presentan la ventaja de una mayor rapidez de respuesta, precisión en las medidas y una completa automatización del procedimiento analítico (142), facilitando su incorporación en línea. Este último aspecto confiere a los biosensores una gran ventaja frente a los sistemas discontinuos.

Otra modalidad de operación la constituye la Inyección Secuencial (143) (SIA,

Sequential Inyection Analysis), cada vez más utilizada, donde los reactivos se ponen en

contacto con el inmunosoporte de una forma secuencial ordenada, sin existir una corriente portadora continua.

Este campo es un área activa de investigación que ha permitido desarrollar diferentes inmunosensores en flujo (144,145), lo que ha supuesto un avance espectacular -especialmente en el campo medioambiental- en los últimos años (146).

Estos sistemas generalmente están basados en protocolos de inmunoensayo heterogéneo con formato competitivo directo, por lo que los procesos básicos suelen coincidir en mayor o menor medida con el desarrollo de un ensayo ELISA (147). Así es usual utilizar marcadores enzimáticos (148). Otros formatos, como el competitivo indirecto, donde es el antígeno la especie inmovilizada, son menos usuales (149).

En el desarrollo de un inmunosensor en flujo basado en formato competitivo, se deben considerar las siguientes etapas: a) inmovilización de la especie activa sobre un

material inerte e insoluble (soporte), b) preparación e inyección de la disolución de muestra y de las especies capaces de reaccionar con la especie inmovilizada, c) lavado de las sustancias no adsorbidas selectivamente sobre el soporte, d) medida de la actividad del marcador, indicativa de la extensión de la inmunorreacción y e) regeneración o sustitución parcial o total del inmunosoporte, para que pueda ser utilizado en sucesivos análisis.

En lo expuesto anteriormente quedan implícitos los problemas que tendrán que abordarse en el desarrollo de los inmunosensores en flujo. Es necesario conocer los soportes potencialmente útiles de inmovilización de inmunorreactivos, los procedimientos de inmovilización y las condiciones de regeneración del inmunosoporte, entre otros.

1.5.1.1. Soportes de inmovilización de inmunorreactivos

A la hora de desarrollar los inmunosensores heterogéneos en flujo, el principal aspecto a tener en cuenta es la separación de los inmunorreactivos libres de los inmunocomplejos formados. Para tal fin, una de las especies debe estar inmovilizada en un soporte sólido. Generalmente, las propiedades requeridas en dichas fases sólidas son: (i) alta capacidad de inmovilización de inmunorreactivos (alta relación superficie/volumen), (ii) posibilidad de inmovilización de diferentes tipos de inmunorreactivos, (iii) mínima disociación, (iv) desnaturalización despreciable de la especie inmovilizada, y (v) posibilidad de inmovilización orientada.

En el caso concreto de trabajar con medios orgánicos, la compatibilidad del soporte y de cualquier reactivo o material utilizado es también una característica indispensable. Así pues, en el desarrollo de sistemas en medios orgánicos, será necesario realizar -entre otros aspectos- una evaluación exhaustiva de los materiales a utilizar como inmunosoportes

Los soportes particulados son los mas ampliamente empleados en el desarrollo de inmunosensores. De ellos destacan los soportes silíceos, ya que permiten varios modos de inmovilización de antígenos o anticuerpos, bien químicamente o por simple adsorción. Además, estos soportes son muy estables mecánicamente, compatibles con la mayoría de los sistemas de detección empleados y resistentes a los disolventes orgánicos. Otro gran grupo lo constituyen los geles. Estas sustancias derivadas principalmente de la agarosa, son ampliamente utilizadas en diversas aplicaciones

debido a la posibilidad de su funcionalización, lo que permite la inmovilización covalente y orientada de los inmunorreactivos.

Otro grupo de soportes de inmovilización lo forman las membranas, generalmente derivatizadas para la inmovilización de los inmunorreactivos (preferentemente anticuerpos). En sistemas en flujo, estos soportes se utilizan para la preparación de reactores de membrana, con la ventaja inherente de la ausencia de compactación del soporte –como ocurre en los reactores de lecho empaquetado-, si bien estos sistemas han sido poco aplicados y sin demasiado éxito (148).

1.5.1.2. Modos de inmovilización

El modo de inmovilización es una variable de considerable importancia, puesto que puede influir en las prestaciones analíticas del inmunosensor, es decir en la sensibilidad y especificidad (150). En muchas ocasiones, el proceso de inmovilización redunda en un incremento de la estabilidad de la molécula, como se mencionó anteriormente para el caso de enzimas. En este sentido, existen una serie de factores relacionados directamente con el modo de inmovilización, que afectan en particular al buen funcionamiento del inmunosensor. De ellos cabe destacar: (i) estabilidad del inmunosoporte -en moléculas bioactivas la inmovilización produce una estabilización;

(ii) orientación de la biomolécula- en el caso de anticuerpos la inmovilización orientada

facilita la interacción Ab-Ag de modo que la actividad y la sensibilidad aumenta; (iii)

actividad del inmunosoporte -relacionado con la regeneración de la superficie activa;

(iv) reacciones inespecíficas- inmovilizar una especie u otra puede influir en la

magnitud de las señales inespecíficas, ya que las especies auxiliares utilizadas en la detección de la interacción son distintas; (v) rapidez del ensayo -la duración del ensayo

está condicionada por el formato de ensayo, que depende a su vez de la especie inmovilizada; (vi) viabilidad de inmovilización- dependiente de los grupos funcionales

presentes, tanto en la especie a inmovilizar como en el soporte.

En la práctica, todos estos factores -esenciales para un correcto desarrollo de inmunosensores- han sido poco estudiados, por lo que la información sobre estos aspectos que garantice resultados inmediatos es escasa. En definitiva, son muchas las variables y aspectos a tener en cuenta antes de decidir el formato de ensayo a utilizar (anticuerpo o antígeno inmovilizado). En la Tabla 1.13, se muestran los modos de inmovilización más empleados.

Tabla 1.13. Modos de inmovilización de anticuerpos y haptenos

Indirecta Proteínas de captura, IgGs, lectinas Adsorción: membranas No-covalente Encapsulamiento: soportes Sol-Gel Anticuerpo Directa Covalente Activación química del soporte

Indirecta Vía conjugado

proteico Modos de

Inmovilización

Hapteno

Directa covalente Enzimáticamente Fotoquímicamente

1.5.1.3. Reversibilidad y reusabilidad

Los inmunosensores deben ser capaces de detectar el analito de forma continua, reversible y selectiva. De dichos términos cabe destacar el término reversibilidad, lo que supone revertir la unión inmunoquímica, proceso posible gracias a la naturaleza no covalente de los enlaces entre los anticuerpos y antígenos (151). La regeneración de los inmunosoportes es una opción descartable para algunos autores (152), debido a que este proceso supone exponer al inmunocomplejo a condiciones de desnaturalización proteica, con la consiguiente posibilidad de pérdida de actividad del reactivo inmovilizado. Sin embargo, en la mayoría de los casos se reutilizan los inmunosoportes mas de una vez, llegando incluso en casos excepcionales hasta varios cientos de veces (153). Hay que señalar que, en todos los casos, el inmunosoporte posee una vida útil limitada debido a la desnaturalización del reactivo inmovilizado o a la pérdida de las propiedades del soporte.

El agente desorbente escogido para regenerar un inmunosoporte debe romper la interacción Ab-Ag, manteniendo mas o menos intacta la actividad del inmunorreactivo inmovilizado. Las sustancias empleadas para ello son disoluciones de alta concentración salina o pH ácido y disolventes orgánicos (154,155). Así, por ejemplo, en los sistemas basados en anticuerpo inmovilizado (formato competitivo directo), la vida útil del inmunosoporte dependerá de la afinidad del anticuerpo por su antígeno. Por ello, si los anticuerpos son de muy alta afinidad, la reversión de la interacción inmunoquímica será

extremadamente difícil (35), lo que supondrá un sistema de un solo uso y los inmunosensores resultantes serán poco prácticos. Por el contrario, anticuerpos de baja afinidad darán sistemas altamente reusables, pero de baja sensibilidad frente al analito para el que se diseñó. Así pues, es necesario establecer un compromiso entre sensibilidad y reusabilidad (156). En general, la elección de un agente desorbente adecuado es un factor clave ya que debe producir una desorción efectiva minimizando su influencia.