MÉTODOS DE RMN BASADOS EN LA OBSERVACIÓN DEL LIGANDO

Los métodos basados en la observación de las señales del ligando se apoyan en el hecho de que es posible distinguir entre los estados libre y asociado desde el punto de vista de la RMN, gracias a las diferencias de la velocidad rotacional y traslacional de una molécula pequeña al pasar del estado libre al asociado. Las aproximaciones basadas en la observación del ligando se basan en la transferencia, mediada por intercambio químico de la información del estado asociado al estado libre. Este requisito hace que

estos métodos sean especialmente útiles para la identificación de ligandos con afinidades entre débiles y moderadas (intercambio relativamente rápido, con koff mayor de 2-3 s-1). Generalmente, los ligandos son moléculas con un peso molecular inferior a 1 kDa y se caracterizan por tener tiempos de correlación cortos, lo que se traduce en velocidades de relajación lentas y coeficientes de difusión translacional relativamente altos. Sin embargo, cuando se asocian a una macromolécula, sus propiedades de RMN cambian y adquieren las propiedades de ésta.

La ventaja de este método radica en que se evita la necesidad de producir grandes cantidades del receptor marcado isotópicamente. Además, tampoco es necesaria la asignación de la proteína, ni imprescindible el conocimiento de su estructura tridimensional. La ausencia de estos requisitos hace que estos métodos sean más rápidos y de mayor aplicabilidad al estudio de los procesos de formación de los complejos que los basados en la observación del receptor. Obviamente, la información relativa al receptor que se puede obtener con estos métodos es más limitada que en los anteriores, aunque, en casos favorables, pueden complementarse eficazmente con protocolos de docking.

3.1.1 Diferencia de Transferencia de Saturación (STD)

Esta técnica no tiene límite superior del tamaño de la molécula del receptor y se puede aplicar para detectar cualquier interacción ligando-receptor, siempre que exista la posibilidad de irradiar selectivamente las señales de RMN del receptor. Experimentalmente, para las proteínas, la irradiación selectiva se realiza típicamente en la región aromática (si los ligandos son carbohidratos) o en la región alifática de campo alto (ca -2 ppm), donde hay una densidad relativamente alta de señales de proteína y no hay resonancias de ligando [110-111]. La saturación se mantiene durante un determinado periodo (de centenares de milisegundos a unos pocos segundos) y en este intervalo, la magnetización se transfiere a través del espacio a todos los protones de la proteína. Si un ligando interacciona con la proteína, sus protones también sentirán la transferencia desde los núcleos del polipéptido y, por tanto, se afectarán sus intensidades (Figura 1.13). Si el experimento STD se realiza con una biblioteca de moléculas pequeñas, solamente se afectaran las señales de RMN de aquellas moléculas que interaccionen con el receptor. Desde el punto de vista experimental, el experimento se realiza en el modo de diferencia. Es decir, al espectro resultante de la saturación

mencionada antes se le resta el obtenido mediante saturación en una región de espectro sin señales (ca. 100 ppm). El espectro diferencia sólo muestra las señales de los ligandos que interaccionan con el receptor. Además, dependiendo del tiempo de saturación y de la velocidad de disociación del complejo, los protones del ligando que mostrarán mayor transferencia de saturación serán aquellos que estén más cerca de los protones del receptor, lo que puede permitir deducir el epítopo del ligando.

Este método se ha utilizado para determinar afinidades absolutas y relativas mediante experimentos de competición y de titulación. Pero quizás, el aspecto más elegante del método STD es que también permite conocer la región del ligando que está en contacto más intimo con el receptor (epítopo) [112].

Figura 1.13 Representación de un experimento STD. Cuando el ligando interacciona con la proteína

saturada, la saturación se transfiere al ligando. Los protones del ligando que están en contacto con el sitio de unión se afectan antes y más fuertemente por la saturación de los protones de la proteína.

El experimento STD presenta ciertas características que merecen ser resaltadas. Primero, el STD es ideal para el estudio de receptores de gran tamaño (> 30 kDa) que son los que generalmente se encuentran durante el proceso de descubrimiento de fármacos. Las macromoléculas con grandes pesos moleculares poseen tiempos de correlación rotacional grandes que favorecen la difusión de espín, y consecuentemente, la transferencia de saturación entre el receptor y el ligando es muy eficaz. Segundo, los experimentos STD no necesitan de altas concentraciones de receptor (~ l-50 µM). Si asumimos un intercambio lo suficientemente rápido del ligando, la población de ligandos saturados crece durante el tren de pulsos de radiofrecuencias sostenido, debido

a sus bajas velocidades de relajación en el estado libre. A través de este mecanismo, una pequeña cantidad de receptor puede lograr un gran efecto de amplificación del ligando saturado. Una tercera ventaja de este método es que sólo se observan las señales del ligando unido. No hay que hacer correcciones basadas en la contribución del estado libre que podrían complicar la interpretación. Esto es particularmente útil cuando se emplea un diseño experimental donde existe una proporción elevada ligando: receptor. Se estima que el rango de aplicación de esta técnica va desde constantes de disociación 10 -8 _{< K}

d < l0 -2.

3.1.2 Experimentos de medidas de tiempo de relajación T1

Las variaciones de los tiempos de relajación longitudinales T1 o de las inversas de las velocidades de relajación, R1 (1/T1), utilizando sus versiones selectivas (T1,s) pueden también utilizarse para detectar la existencia de entidades supramoleculares en disolución [113]. De hecho, existe una contribución muy importante del tiempo de correlación tc al valor de T1,S, con lo que la medida de este parámetro también proporciona información muy útil sobre la existencia o no de reconocimiento. Así, las medida de T1,S se han utilizado en experimentos de cribado de moléculas mediante RMN, e incluso se han utilizado para determinar constantes de disociación en experimentos de titulación.

3.2 MÉTODOS DE RMN BASADOS EN LA OBSERVACIÓN DE LA