Esquema II.1. Equilibrio tautomérico entre las formas ortoéster-TTX (1a)
F. M Eur J Pharmacol 2006, 541, 9-16; y referencias citadas.
32 Canal Genes Humanos Velocidad de inactivación Sensibilidad
frente a TTX Localización Principal
Na
v1.1 SCN1A rápido TTX-S CNS y DRG
Na
v1.2 SCN2A rápido TTX-S CNS y DRG
Na
v1.3 SCN3A rápido TTX-S CNS embrionario
Na
v1.4 SCN4A rápido TTX-S Músculo esquelético
Na v1.5 SCN5A Lento TTX-R Miocitos cardiacos y DRG Na v1.6 SCN8A rápido TTX-S Neuronas motoras PNS y DRG Na v1.7 SCN9A rápido TTX-S DRG y CNS Na v1.8 SCN10A Lento TTX-R PNS y DRG Na v1.9 SCN11A Lento TTX-R PNS y DRG Na x SCN7A --- --- ---
Clave: TTX-S = sensible a TTX; TTX-R = resistente a TTX; CNS = sistema nervioso central; DRG = ganglios de la raíz dorsal; PNS = sistema nervioso periférico.
Tabla II.4. Clasificación, propiedades y distribución de las isoformas
de los canales de Na+ dependientes del voltaje.62
Según la sensibilidad frente a tetrodotoxina (TTX, 1) las diferentes isoformas pueden clasificarse en:
a) Canales sensibles a TTX (TTX-S): Nav1.1-Nav1.4, Nav1.6 y Nav1.7, con un valor de IC50 de rango nanomolar.63
b) Canales resistentes a TTX (TTX-R): Nav1.5, Nav1.8 y Nav1.9, con un valor de IC50 de orden micromolar.
Cada una de estas isoformas se expresa mayoritariamente en tipo de tejido determinado (Tabla II.4). Se establece que los canales Nav1.1-Nav1.3 y Nav1.7 se
62 Tabla elaborada a partir de los datos recogidos en Refs. 57b y 58a,b. 63 (a) En este caso, el término IC
50 es utilizado para indicar la concentración molar de TTX que
inhibe al 50% el transporte de iones a través del canal Nav. (b) Para una revisión general de los
parámetros usados para cuantificar las interacciones ligando-receptor recomendados por la Unión Internacional de Farmacología (IUPHAR), ver: Neubig, R.R.; Spedding, M.; Kenakin, T.; Christopoulos, A. Pharmacol. Rev. 2003, 55, 597-606.
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encuentran principalmente en el sistema nervioso central (CNS), los Nav1.4 en el músculo esquelético, los Nav1.5 en el corazón y las isoformas Nav1.8 y Nav1.9 en el sistema nervioso periférico (PNS).64
D.1.2. Estructura de los Canales Nav65
Los canales de Na+ dependientes del voltaje están constituidas por una subunidad de 260 kDa, formadora del poro, asociada a una o más subunidades auxiliares de 33-45 kDa (Figura II.6).
La subunidad se compone de cuatro dominios homólogos (DI-DIV), cada uno contiene seis segmentos helicoidales (S1-S6) que atraviesan la membrana plasmática, y presenta los grupos amino y carboxilo terminal situados intracelularmente.
Los segmentos transmembrana están conectados mediante pequeños bucles, siendo el mayor de ellos el que enlaza S5 y S6 de forma extracelular reentrando en la membrana. Por otra parte, los cuatro dominios se unen a través de lazos citoplasmáticos grandes.
El segmento S4 de cada dominio es anfipático y contiene numerosos residuos cargados positivamente de arginina y/o lisina, junto a otros residuos hidrofóbicos, lo que le permite actuar como sensor de voltaje del canal.66 Dichos residuos responden a la despolarización (decrecimiento del potencial) de la membrana orientando sus cargas positivas hacia el exterior del poro, lo que inicia la activación (apertura) del canal y permite que los iones Na+ lo atraviesen.
64 (a) Mechaly, I.; Scamps, F.; Chabbert, C.; Sans, A.; Valmier, J. Neuroscience 2005, 130,
389-396. (b) Refs. 58c y 60.
65 Ver: Referencia 58.
66 (a) Yang, N.; George, A.L.Jr.; Horn, R. Neuron 1996, 16, 113-122. (b) Stühmer, W.; Conti, F.;
34 Poro Compuerta Inactivación Filtro Selectividad Sensor Voltaje Modulación Membrana Intracelular Extracelular Subunidad Subunidad DIV DIII DII DI Bucles P
fosforilación por quinasas A (circulos) y C (rombos) Poro (dmin ~2.5 ) Configuración cada Dominio Configuración Subunidad
Figura II.6. Representación esquemática de la estructura de los canales de Na+
dependientes del voltaje (se muestra la organización transmembrana de su subunidad ).67
Los segmentos S5 y S6 de los cuatro dominios, así como el lazo intramembrana P (re-entrante) que los unen, conforman el poro conductor de iones (Figura II.7).68,69 El vestíbulo exterior del poro está constituido por los
67
Figura modificada de Ref. 58a.
68 Sobre la modelización molecular de la estructura del poro de los canales de sodio
dependientes del voltaje, ver: (a) Scheib, H.; McLay, I.; Guex, N.; Clare, J.J.; Blaney, F.E.; Dale, T.J.; Tate, S.N.; Robertson, G.M. J. Mol. Model 2006, 12, 813-822. (b) Lipkind, G.M.; Fozzard, H.A. Biochemistry 2000, 39, 8161-8170. (c) Bénitah, J-P.; Ranjan, R.; Yamagishi, T.; Janecki, M.; Tomaselli, G.F.; Marban, E. Biophys. J. 1997, 73, 603-613. (d) Lipkind, G.M.; Fozzard, H.A. Biophys. J. 1994, 66, 1-13.
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cuatro bucles P cuyo alineamiento agrupa un conjunto de cuatro aminoácidos (aspartato, glutamato, lisina y alanina, secuencia DEKA), cada uno de ellos perteneciente a un dominio distinto, formando la parte más estrecha del poro que funciona como filtro de selectividad.70 Cuando la proteína está en su configuración activa, estos aminoácidos se encuentran próximos unos de otros formando un anillo con carga neta de -1e. El extremo intracelular del poro es más ancho y está formado por los segmentos S5 y S6 de cada dominio.
Figura II.7. Modelo molecular del vestíbulo exterior del canal de Nav que incluye los
bucles P y los segmentos S5 (en amarillo) y S6 (en rosa) de sus cuatro dominios I-IV.71
El pequeño lazo intracelular que conecta los dominios homólogos III (S6) y IV (S1) es esencial para la rápida inactivación del canal de Na+. En particular,
69
Para una imagen de un canal Nav obtenida utilizando microscopía crioelectrónica con una
resolución de 19 Å, ver: Sato, C.; Ueno, Y.; Asai, K.; Takahashi, K.; Sato, M.; Engel, A.; Fujiyoshi, Y. Nature 2001, 409, 1047-1051.
70 (a) Sun, Y.M.; Favre, I.; Schild, L.; Moczydlowski, E. J. Gen. Physiol. 1997, 110, 693-715.
(b) Heinemann, S.H.; Terlau, H.; Stühmer, W.; Imoto, K.; Numa, S. Nature 1992, 356, 441-443.
71 Modelo molecular del poro de los canales Na
v propuesto por Lipkind y Fozzard [Ref. 68d].
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son críticos tres residuos aminoácidos hidrofóbicos (isoleucina, fenilalanina y metionina, conocida como secuencia IFM), que actúan como una compuerta de inactivación que bloquea la boca interior del poro durante la despolarización de la membrana.72
Por otra parte, han sido identificados algunos sitios de fosforilación por las proteínas quinasas A (PKA) y C (PKC) en los lazos interiores que conectan los dominios I-II, por un lado, y III-IV, por otro.73 Ambas quinasas A y C han sido implicadas en procesos de dolor inflamatorio y neuropático, respectivamente.74
Aunque la expresión de la subunidad por si sola es suficiente para formar el canal iónico, las subunidades adicionales modulan su funcionamiento, siendo especialmente importantes durante la expresión, localización y plegamiento del canal.75 Estas proteínas contienen un único dominio transmembranal con el extremo amino extracelular y el carboxilo final intramolecular.
D.1.3. Funcionamiento de los Canales Nav58
Los canales de Na+ dependientes del voltaje presentan al menos tres estados conformacionalmente funcionales (Figura II.8): de reposo (cerrado pero activable), activo (abierto) e inactivo (cerrado).
72 (a) Rohl, C.A.; Boeckman, F.A.; Baker, C.; Scheuer, T.; Catterall, W.A.; Klevit, R.E.
Biochemistry 1999, 38, 855-861. (b) West, J.W. Patton, D.E.; Scheuer, T.; Wang, Y.; Goldin,
A.L.; Catterall, W.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 10910-10914.
73
(a) Murphy, B.J.; Rossie, S.; De Jongh, K.S.; Catterall, W.A. J. Biol. Chem. 1993, 268, 27355-27362. (b) West, J.W.; Numann, R.; Murphy, B.J.; Scheuer, T.; Catterall, W.A. Science
1991, 254, 866-868.
74 Yajima, Y.; Narita, M.; Shimamura, M.; Narita, M.; Kubota, C.; Suzuki, T. Brain Res. 2003, 992, 288-293.
75 (a) Hanlon, M.R.; Wallace, B.A. Biochemistry 2002, 41, 2886-2894. (b) Isom, L.L. Am. J.
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rápida
Despolarización
lenta
Repolarización
REPOSO ACTIVADO INACTIVADO
Na+
Na+
Na+
Figura II.8. Relación entre los estados de reposo, activo e inactivo de los canales Nav.76
Bajo el potencial residual de membrana (menores a -60 mV), los canales Nav suelen encontrarse cerrados y no son conductores (en un estado de reposo). La despolarización de la membrana (disminución del potencial que se hace menos negativo), aumenta la probabilidad de activación del canal, el cual se abre bruscamente permitiendo que los iones Na+ fluyan hacia el interior celular (estado
activo). Esta afluencia de iones cargados positivamente genera una inversión momentánea de la polaridad que constituye el potencial de acción. Cuando se produce la despolarización, los segmentos cargados S4 de cada dominio homólogo, sensores de voltaje, se desplazan hacia el exterior de la membrana iniciando un cambio conformacional que implica a los bucles intramembrana P y abre el poro del canal (Figura II.8).
La inactivación (cierre) del canal Nav se produce de forma rápida (en milisegundos) e inmediatamente después de su apertura. El lazo intracelular que conecta los dominios III y IV contiene la secuencia hidrofóbica IFM que se comporta como una tapadera que cierra el poro del canal por su extremo citoplasmático, permaneciendo así durante toda la despolarización y abriéndose
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únicamente cuando se vuelve a repolarizar la membrana (Figura II.8). Esta inactivación rápida de los canales de sodio debe contribuir a la terminación del potencial de acción y a la regulación del periodo refractario posterior.
Cuando las despolarizaciones son prolongadas, los canales Nav sufren un proceso conocido como inactivación lenta (de segundos a minutos). En este caso, el mecanismo de inactivación es más complejo e involucra el alineamiento adicional de una serie de aminoácidos de los segmentos S6. Esta inactivación lenta debe contribuir sobre todo a la excitabilidad de la membrana al incrementar el umbral del potencial de acción, de tal modo que limitan su duración y propagación a través del axón neuronal.
Una vez el canal Nav ha alcanzado el estado inactivo, éste debe recuperar de nuevo el estado activable de reposo para poder abrirse en la despolarización siguiente. Esta recuperación ocurre durante la repolarización de la membrana e involucra el movimiento de los segmentos S4 hacia el interior de la membrana y de la puerta de inactivación IFM lejos de la boca intracelular del poro (Figura II.8).
D.2. Interacción entre TTX y los Canales Nav77
La tetrodotoxina (TTX, 1) y la saxitoxina (STX) se unen de forma competitiva a un sitio específico (sitio 1) de la subunidad de los canales Nav, bloqueando el extremo extracelular del poro e inhibiendo el transporte de iones Na+ a través de la membrana plasmática (Tabla I.5). La unión de la TTX al canal
77
Sobre la interacción entre TTX y los canales Nav, ver: (a) Kobayashi, J.; Ishibashi, M. en Comprehensive Natural Products Chemistry; Mori, K. Ed.; Elsevier: Amsterdam, 1999; Vol. 8,
p. 485-489. (b) Soong, T.W.; Venkatesh, B. Trends Gen. 2006, 22, 621-626. (c) Choudhary, G.; Yotsu-Yamashita, M.; Shang, L.; Yasumoto, T.; Dudley, S.C. Jr. Biophys. J. 2003, 84, 287- 294. (d) Narahashi, T. J. Toxicol. Toxin Rev. 2001, 20, 67-84. (e) Penzotti, J.L.; Fozzard, H.A.; Lipkind, G.M.; Dudley, S.C. Jr. Biophys. J. 1998, 75, 2647-2657. (f) Yang, L.; Kao, C.Y. J.
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Nav es reversible (permanecen enlazadas unas decenas segundos), extremada- mente fuerte (Kd = 1-10 nM)78 e independiente de la conformación del canal.
Sitio de unión (receptor) Ligandos Dominios Efecto fisiológico
membrana 1 tetrodotoxina saxitoxina -conotoxina IS2-S6, IIS2-S6 IIIS2-S6, IVS2-S6 inhiben el transporte de iones 2 veratridina batrachotoxina aconitina grayanotoxina
IS6, IVS6 activación persistente abren el canal,
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