Les cisteïnes que participen en la reducció del NTP s’han de tornar a reduir per poder catalitzar un altre cicle de reducció d’un altre ribonucleòtid diferent. Aquest poder reductor el proporciona un sistema de reductases tiol-depenent constituït per unes proteïnes petites (9-16 kDa), anomenades tioredoxines i glutaredoxines, que són les encarregades de tornar a reduir el grup disulfit S-S de l’extrem C-terminal de la RNR (38).
En el cas d’E. coli, aquest codifica en el seu genoma per dos tioredoxines
(Trx1 i Trx2), tres glutaredoxines (Grx1, Grx2 i Grx3) i dos glutaredoxines-like (Grx4 i NrdH) (39). La primera tioredoxina que es va descobrir (Trx1) va ser identificada per la seva participació en la reducció dels NTPs (Taula 2) (39, 40).
Tant les tioredoxines com les glutaredoxines conserven el motiu CXXC, amb dos cisteïnes en la seqüència, en el seu centre actiu (41). Diferents estudis han identificat aquest motiu conservat com imprescindible per la regeneració del centre
actiu en la proteïna R1 de la RNR de classe Ia (42). Encara que mantinguin el centre actiu conservat, els dos sistemes redox difereixen a l’interior de la cèl·lula variant la manera en que es redueixen: mentre que les tioredoxines ho fan directament mitjançant una tioredoxina reductasa (TrxR) i el NADPH, les glutaredoxines ho fan via la proteïna glutatió (GSH) (43).
Taula 2 adaptada de Meyer et al., 2009 (39): Descripció de les redoxines presents en E. coli. Proteïna Gen Tamany Centre Redox Reductant
Trx1 trxA 127 aa WCGPC NADPH/Trx Reductasa
Trx2 trxC 139 aa WCGPC NADPH/Trx Reductasa
Grx1 grxA 85 aa GCPYC Glutatió Reduït
Grx2 grxB 215 aa HCPYC Glutatió Reduït
Grx3 grxC 82 aa TCPYC Glutatió Reduït
Grx4 grxD 115 aa FCGFS
La 1/2 de la barreja de disulfit amb glutatió és reduïda per TrxR o Grx1
NrdH nrdH 81 aa DCVQC TrxR
Estudis in vitro i in vivo han demostrat que tant la Trx1, Trx2, Grx1 i amb menys eficiència la Grx3 són capaces de proveir del potencial reductor requerit per les RNR (44, 45). Tot i així, la Txr1 és la preferent a l’hora de proveir els electrons en la RNR de classe Ia in vivo. En el cas de la classe Ib, aquest potencial ve donat per una glutaredoxina-like codificada dins del mateix operó que codifiquen les proteïnes R1 (NrdE) i R2 (NrdF) d’aquesta classe (46). Per altre banda, la RNR de classe II pot utilitzar el mateixos reductants que la classe I (47). I, per últim, la classe III RNR és la més diferent ja que el potencial reductor ve donat per una molècula molt senzilla com és el format, encara que alguns estudis, que necessiten ser corroborats, descriuen que necessita de l’activació d’una Trx (48). Més endavant s’explicarà amb més detall les diferències entre els mecanismes redox de les diferents classes de RNR.
Últimament s’està investigant el disseny de medicaments contra les tioredoxines i glutaredoxines com a una altre estratègia per combatre les infeccions bacterianes i el càncer. La inhabilitació del d’aquest sistema redox promouria la
inhibició de les RNR bacterianes o humanes reduint els efectes tòxics per les cèl·lula no maligne (49-51).
En el proper apartat s’explicaran les diferències entre les tioredoxines i les glutaredoxines quant al mecanisme que fan servir per reduir el pont disulfit de la RNR.
3.1.4.1.1 Sistema de tioredoxines
Les tioredoxines d’E. coli comparteixen els residus Cys-Gly-Pro-Cys en el
centre actiu amb la resta de tioredoxines presents en altres éssers vius (52). Aquest sistema disulfit reductasa es poc eficient, posseeix una activitat 8 vegades inferior al sistema de glutaredoxines (53).
La TrxR (tioredoxina reductasa) s’uneix a una butxaca hidrofòbica constituïda pels residus Phe12, Phe27, Phe81 i Leu58 i utilitza els electrons provinents del NADPH per catalitzar la reacció en que el centre actiu disulfit de la Trx queda reduït (54). La reacció és dona mitjançant les dos reaccions: una primera encarregada de generar el potencial reductor de la tioredoxina a través del NADPH i una segona que empra aquest poder reductor per regenerar el sistema redox de la RNR (Figura 4):
NADPH+H+ Tioredoxin Reductasa NADP+
Trx-(SH)2 Trx-S2
NTP dNTP
T RNR
Figura 4: Esquema de la reducció dels NTP mitjançant el sistema redox de la Trx. La Trx abstrau el potencial redox del NADPH+H+ per reduir el NTP.
3.1.4.1.2 Sistema de glutaredoxines
Per una altre banda, totes les glutaredoxines presents en E. coli comparteixen un centre actiu conservat Cys-Pro-Tyr-Cys. Aquest sistema redox és capaç no només de catalitzar reaccions via ditiols (igual que el sistema de tioredoxines) sinó també via un mecanisme que utilitza monotiols (55-57).
El sistema de glutaredoxines requereix del glutatió (o proteïna GSH) per dur a terme la reducció, a més a més, d’una glutatió reductasa (GR) encarregada de captar els hidrògens del NADPH i reduir aquest glutatió. Una vegada reduït, el glutatió transfereix el poder reductor a la glutaredoxina, a diferència del sistema de tioredoxines a on la Trx capta els hidrògens directament del NADPH (Figura 5) (43). El glutatió s’uneix a un solc de la glutaredoxina format pels residus: Tyr13, Thr50, Thr51, Val52 i Arg40 (58).
NADPH+H+ Glutatió Reductasa NADP+
GSSG 2 G 2GSH
Grx-(SH)2 Grx-S2
NTP dNTP
G RNR
Figura 5: Esquema de la reducció dels NTP mitjançant el sistema redox de la Grx. La glutaredoxina obté el potencial redox per dur a terme la catàlisi de l’oxidació del glutatió (GSH), que al mateix temps l’abstrau de la molècula NADPH+H+.
El rol que presenta el sistema de glutaredoxines per la regeneració de la RNR es pot correlacionar amb estudis que mostren com la concentració del GSH augmenta a mesura que també ho fa la proliferació cel·lular i per contra, la limitació d’aquesta proteïna la limita (59).