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Prevalence of Enterotoxigenic Escherichia coli and Shiga toxin-producing Escherichia coli from clinical healthy pigs in Buenos Aires Province

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.3 Aislamiento, caracterización fenotípica, genotípica y subtipificación molecular de los aislamientos de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O

3.3.1 Metodología de recuperación de aislamientos de Escherichia col

portadores de genes de virulencia. Para la recuperación de las cepas portadoras de los genes de virulencia detectados en la segunda etapa de la tesis doctoral, se organizó un esquema de trabajo distribuido en seis pasos:

 Primer paso: se trabajó con los cultivos primarios conservados a – 70º C, con la intención de corroborar la presencia de las bacterias portadoras de los genes detectados en la Etapa 2 característicos de ETEC, STEC y E. coli O157 no toxigénico.

 Segundo paso: análisis de la confluencia resultante del repique desde el medio líquido al sólido.

 Tercer paso: análisis de pooles de colonias aisladas.

 Cuarto paso: análisis de sub-pooles de colonias aisladas.

 Quinto paso: detección de colonias portadoras de los genes buscados.

 Sexto paso: reaislamiento de la colonia portadora del gen detectado para su posterior caracterización fenotípica, genotípica y subtipificación molecular.

Primer paso: se sembró el volumen total de la suspensión bacteriana almacenada a - 70° C en 3 ml de CTS (Britania), incubándose a 42° C durante 24 horas. Posteriormente, a partir de 1 ml del cultivo en ATS, se realizó la extracción del ADN molde según lo descripto en la Etapa 1. Este primer paso concluyó con la realización de la PCR correspondiente. En caso de obtener la amplificación del gen buscado, se continuó con el siguiente paso. Los resultados negativos fueron considerados como “cepas no recuperadas”.

Segundo paso: en aquellos casos en los cuales se detectaron los genes buscados, se procedió al aislamiento de las cepas portadoras desde el medio líquido a medio sólido. Con la finalidad de concentrar la masa bacteriana, se centrifugó 1 ml del cultivo en CTS durante 15 minutos a 5000 rpm. Posteriormente, se colocaron 10 µl de sedimento en una placa de agar Mac Conkey y se realizó la siembra por agotamiento en la misma placa y en tres placas de EMB (Agar Eosina Azul de Metileno) (Britania). Se repitieron las condiciones de incubación previamente mencionadas. A partir de la estría inicial en agar Mac Conkey, se tomó una ansada y se colocó en 150 µl de buffer Tris-EDTA-Tritón 1X con la intención de preparar el ADN molde, realizándose nuevamente la PCR correspondiente. En caso de obtener la amplificación del gen buscado, se continuó con el siguiente paso. El resultado negativo fue considerado como “cepa no recuperada”.

En este paso, se tomaron 700 µl del cultivo en CTS y se adicionaron 300 µl de glicerol conservándose nuevamente a – 70º C.

Figura 14a. ETAPA 3: Aislamiento, caracterización fenotípica y genotípica, subtipificación molecular de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O157 no

toxigénicos

Tercer paso: análisis de pooles de colonias aisladas. De aquella confluencia positiva al o a los genes detectados, a partir de las placas de EMB, se repicaron en ATS 60 colonias características de E. coli (brillo verde metalizado). Se mantuvieron las mismas condiciones de incubación previamente descriptas. El tercer paso, se produjo preparando los ADN moldes a partir de seis pooles de 10 colonias cada uno, realizándose nuevamente la PCR correspondiente. En caso de obtener la amplificación del gen buscado, se continuó con el siguiente paso. El resultado negativo fue considerado como “cepa no recuperada”.

Figura 14b. ETAPA 3: Aislamiento, caracterización fenotípica y genotípica, subtipificación molecular de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O157 no

toxigénicos

Cuarto paso: análisis de sub-pooles de colonias aisladas. Se prepararon nuevos ADN moldes a partir de las colonias que conformaron el pool positivo al gen buscado. En este cuarto paso, los pooles estuvieron conformados con 5 colonias. Se realizó nuevamente la PCR correspondiente. En caso de obtener la amplificación del gen buscado, se continuó con el siguiente paso. El resultado negativo fue considerado como “cepa no recuperada”.

Figura 14c. ETAPA 3: Aislamiento, caracterización fenotípica y genotípica, subtipificación molecular de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O157 no

toxigénicos

Quinto paso: detección de colonias portadoras de los genes buscados. Las colonias que conformaron el sub-pool en el cual se produjo la amplificación del gen buscado, se repicaron en ATS incubándose durante 24 horas a 37º C. Se realizaron los ADN moldes de cada una de las colonias individualmente, tomando una ansada de las mismas en 150 µl de buffer Tris-EDTA-Tritón 1X. Luego de colocarlas durante 15 minutos en baño de agua hirviente y centrifugarlas según lo anteriormente descripto, se realizó nuevamente la PCR correspondiente. En caso de obtener la amplificación del gen buscado, se continuó con el siguiente paso. El resultado negativo fue considerado como “cepa no recuperada”.

Figura 14d. ETAPA 3: Aislamiento, caracterización fenotípica y genotípica, subtipificación molecular de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O157 no

toxigénicos

Sexto paso: re-aislamiento de la colonia portadora del gen detectado, para su posterior caracterización fenotípica, genotípica y subtipificación molecular. La colonia detectada como portadora del gen buscado se repicó en ATS y se incubó bajo las mismas condiciones descriptas en el quinto paso. A partir de una colonia aislada se continuó realizando la metodología correspondiente para el desarrollo de los pasos siguientes: conservación a – 70º C e ingreso al cepario, siembra de pruebas fisiológicas y bioquímicas, siembra en CTS para la realización de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana y extracción de ADN, siembra en agar semiblando para las pruebas serológicas.

Figura 14e. ETAPA 3: Aislamiento, caracterización fenotípica y genotípica, subtipificación molecular de Escherichia coli toxigénicos y Escherichia coli O157 no

toxigénicos