7. ANÁLISIS Y DESARROLLO BIOTECNOLÓGICO PARA LA

7.1.1. Análisis de microorganismos

7.1.1.4. Microencapsulamiento

La bioencapsulación consiste en la inmovilización de componentes biológicamente activos en microcápsulas. Para este caso particular, las microcápsulas son pequeñas esferas que contienen los microorganismos (levadura, hongos y bacilos) inmovilizadas en un medio nutritivo. Como analogía al proceso de adaptación de los microrganismos a concentraciones de

0,1 PPM

0,5 PPM

1 PPM

73

fenol, el agente inmovilizado debe tener un tiempo de estabilización en este nuevo medio, antes de poder ser utilizado [33].

Las tecnologías de encapsulación permiten preservar la integridad de los materiales encapsulados, pues estos durante el proceso quedan protegidos por una barrera física que evita su exposición a las condiciones adversas del entorno. Esta técnica consiste en el recubrimiento de pequeñas cantidades de un determinado compuesto bioactivo mediante un material protector que es generalmente de naturaleza polimérica.

Durante la aplicación de estas técnicas, gotas liquidas, partículas sólidas y componentes volátiles son atrapados dentro de una película delgada de un agente microencapsulante con características poliméricas. La selección del método de encapsulación estará en función del tamaño medio de la partícula requerida, de las propiedades físicas del agente encapsulante, de la sustancia a encapsular, de las aplicaciones del material encapsulado propuesto, del mecanismo de liberación deseado y del costo.

7.1.1.4.1. Preparación del cultivo a encapsular:

Se inocula al 10% V/V del medio con células previamente activadas a 3 viales con medio Saboureaud y Malta para hongos. Los microorganismos se adaptan a concentraciones de fenol 0.2, 0.5 y 1ppm.

74

Los hongos utilizados son hongos filamentosos Aspergillus tipo I (Aspergillus niger) y Aspergillus tipo II (Aspergillus terreus)y no filamentosos como Saccharomyces cerevisiae. Los frascos se incubaron a 27°C por 5 días.

Después de este tiempo se cosecha el cultivo.

La encapsulación se realiza mezclando 2% (V/V) del concentrado de células con agar al 3%. La mezcla se hace pasar por una pipeta y se deja gotear sobre una solución aceitosa y se deja que endurezcan por 30 minutos, las cápsulas se enjuagan con solución salina y agua destilada y se colocan dentro de los biosensores.

Figura 25. Cápsulas para los biosensores.

75 7.1.2. Análisis de tejido orgánico

Basados en la búsqueda bibliográfica se seleccionó el champiñón y otras fuentes naturales (papa y manzana) que contienen tirosinasa, es decir, sufren de pardeamiento enzimático.

7.1.3. Desarrollo microorganismos

En esta etapa del proceso se hicieron algunas pruebas para validar el comportamiento del fenol en presencia de diferentes microorganismos, y la relación directa con el oxígeno disuelto, de esta manera verificar algunas hipótesis planteadas en los trabajos realizados previamente.

Se utilizaron las cápsulas de control, levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y hongos (Aspergillus niger) realizadas en el laboratorio, debido a que estos microorganismos tienen presencia de tirosina, aminoácido que realiza le pardeamiento enzimático, lo que permitiría la oxidación del fenol dentro de la mezcla.

La prueba consistía en que cada microorganismo tuviera contacto con el fenol por cierta cantidad de tiempo y comparar el valor de oxígeno disuelto antes y después de realizado este contacto, buscando encontrar el tiempo óptimo para que la enzima realizará su proceso de oxidación. Se hicieron pruebas de uno, tres y cinco minutos con cantidades de fenol de 0,2, 1 y 2 ppm registrando el valor del oxígeno disuelto antes y después del proceso.

76

Para las capsulas de control se realizó una prueba para validar que la sustancia encapsulante no generaba ninguna reacción en presencia del fenol.

Figura 26. Agua destilada con fenol a distintas concentraciones.

 Cápsulas de control: para estas capsulas, se utilizaron 40 gramos para cada prueba, en un volumen total de la muestra de 40 mililitros.

77

Figura 27. Cápsulas de control para las pruebas

Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando las cápsulas de control se presentan en las siguientes tablas y gráficos.

Tabla 6. Pruebas con cápsulas de control para un, tres y cinco minutos de reacción.

78

Figura 28. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con las cápsulas de control durante un, tres y cinco minutos.

Para las cápsulas de control se demuestra que el medio encapsulante es apropiado para esta aplicación, ya que no tiene ninguna reacción en presencia del fenol.

 Cápsulas de levadura blanca: para estas cápsulas, se utilizaron 40 gramos para cada prueba, en un volumen total de la muestra de 40 mililitros.

79

Figura 29. Cápsulas de levadura blanca para las pruebas.

Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando la levadura (Sacharomyces Cerivisae) se presentan en las siguientes tablas y gráficos.

Tabla 7. Pruebas con cápsulas de levadura (Sacharomyces Cerivisae) para un minuto de reacción.

Tiempo (min)

Concentración (Ppm)

0,2 1 2

1

Inicial Final Delta Inicial Final Delta Inicial Final Delta D.O (%) 99,6 96,6 -3 99,6 98,6 -1 99,6 96,9 -2,7 99,7 97,7 -2 99,4 99,1 -0,3 99,6 96,7 -2,9 Media 99,65 97,15 2,50 99,50 98,85 0,65 99,60 96,80 2,80 Desviación 0,07 0,78 0,71 0,14 0,35 0,49 0,00 0,14 0,14

80

Figura 30. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con la levadura blanca durante un minuto.

Tabla 8. Pruebas con cápsulas de levadura (Sacharomyces Cerivisae) para tres minutos de reacción.

Tiempo

Sacharomyces Cerivisae Tiempo de 1

minuto

81

Figura 31. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con la levadura blanca durante tres minutos.

v

Tabla 9. Pruebas con cápsulas de levadura (Sacharomyces Cerivisae) para cinco minutos de reacción.

Tiempo

Sacharomyces Cerivisae Tiempo de 3

minutos

82

Figura 32. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con la levadura blanca durante cinco minutos.

En la siguiente tabla se presenta un consolidado de la media y desviación estándar de la variación de oxígeno disuelto obtenida, con las cápsulas de levadura para cada concentración de fenol en estas pruebas.

Tabla 10. Media desviación de los datos obtenidos en las pruebas con las cápsulas de levadura blanca.

Concentración (ppm)

Sacharomyces Cerivisae Tiempo de 5 minutos

0,2 ppm

1 ppm

2 ppm

83

En la anterior tabla se puede observar que la media de las desviaciones estándar para cada uno de los tiempos posee un valor bajo, lo que se traduce que este experimento tiene una buena repetitividad, haciendo que sea un candidato a seleccionar para la siguiente etapa. Por otra parte, el valor de las medias para el tiempo de 5 minutos, están más distanciadas, es decir, se puede notar una mayor diferencia en la variación del oxígeno disuelto entre concentraciones.

Figura 33. Curvas de calibración Sacharomyces Cerivisae .

 Cápsulas de hongo café: para estas capsulas, se utilizaron 40 gramos para cada prueba, en un volumen total de la muestra de 40 mililitros.

84

Figura 34. Cápsulas de hongo café para las pruebas.

Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando el hongo café (Aspergillus Niger) se presentan en las siguientes tablas y gráficos.

Tabla 11. Pruebas con cápsulas de hongo café (Aspergillus Niger) para un minuto de reacción.

Tiempo (min)

Concentración (Ppm)

0,2 1 2

1

Inicial Final Delta Inicial Final Delta Inicial Final Delta D.O

(%) 98,2 96,6 -1,6 97,2 97,8 0,6 96,7 98,6 1,9 96,8 97,2 0,4 97,5 98,3 0,8 96,8 98,1 1,3 Media 97,50 96,90 1,00 97,35 98,05 0,70 96,75 98,35 1,60 Desviación 0,99 0,42 1,41 0,21 0,35 0,14 0,07 0,35 0,42

85

Figura 35. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con el hongo café durante un minuto.

Tabla 12. Pruebas con cápsulas de hongo café (Aspergillus Niger) para tres minutos de reacción.

Aspergillus Niger Tiempo de 1 minuto

0,2

86

Figura 36. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con el hongo café durante tres minuto.

Tabla 13. Pruebas con cápsulas de hongo café (Aspergillus Niger) para cinco minutos de reacción.

Aspergillus Niger Tiempo de 3 minutos

0,2 ppm

1 ppm

2 ppm

87

Figura 37. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con el hongo café durante un minuto.

En la siguiente tabla se presenta un consolidado de la media y desviación estándar de la variación de oxígeno disuelto obtenida, con las cápsulas de hongo para cada concentración de fenol en estas pruebas.

Tabla 14. Media desviación de los datos obtenidos en las pruebas con el hongo café.

Aspergillus Niger Tiempo de 5 minutos

0,2 ppm

1 ppm

2 ppm

88

En la anterior tabla se puede observar que el valor de la media no varía significativamente lo que sugiere que el hongo requiere más tiempo en contacto con la muestra.

Figura 38. Curvas de calibración Aspergillus Niger.

7.1.4. Desarrollo tejido orgánico

En esta etapa del proceso se hicieron algunas pruebas para validar el comportamiento del fenol en presencia de diferentes tejidos organicos, y la relación directa con el oxígeno disuelto, de esta manera verificar algunas hipótesis planteadas en los trabajos realizados previamente.

89

Se utilizó la papa, la manzana, el champiñón (propuesto en un artículo de referencia) debido a que estos alimentos realizan pardeamiento enzimático lo que permitiría la oxidación del fenol dentro de la mezcla.

Figura 39. Cortes de champiñón para la prueba.

Figura 40. Cortes de papa para la prueba.

Las pruebas se realizaron de la misma manera que se hizo en el desarrollo de microrganismos.

90 Figura 41. Pruebas con el champiñón

Figura 42. Pruebas con manzana.

91 Figura 43. Pruebas con la papa.

 Champiñón: para el champiñón se utilizaron 15 gramos para cada

prueba, con un ancho aproximado de 5 milímetros y un volumen total de la muestra de 40 mililitros.

Figura 44. Cantidad de champiñón utilizado en cada prueba.

92

Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando champiñón se presentan en las siguientes tablas y gráficos.

Tabla 15. Pruebas con champiñón para un minuto de reacción.

Tiempo

Figura 45. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con champiñón durante un minuto.

-4,3

Champiñon Tiempo de 1 minuto

0,2 ppm 1 ppm

93

Tabla 16. Pruebas con champiñón para tres minutos de reacción.

Tiempo

Figura 46. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con champiñón durante tres minutos.

-9,3

Champiñon Tiempo de 3 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

94

Tabla 17. Pruebas con champiñón para cinco minutos de reacción.

Tiempo

Figura 47. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con champiñón durante cinco minutos.

En la siguiente tabla se presenta un consolidado de la media y desviación estándar de la variación de oxígeno disuelto obtenida, con el champiñón para cada concentración de fenol en estas pruebas.

-14,9

Champiñon Tiempo de 5 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

95

Tabla 18. Media desviación de los datos obtenidos en las pruebas con champiñón.

Concentración

0,2 1 2

Tiempo (min) Media Desv Media Desv Media Desv Media desviaciones 1 -3,03 1,78 -3,00 1,54 -2,23 1,53 1,62

3 -10,70 1,22 -14,27 2,57 -17,00 5,46 3,08 5 -14,27 1,01 -17,60 7,86 -21,00 2,52 3,80

En la anterior tabla se puede observar que la desviación estándar para cada uno de los tiempos es un valor significativo, lo que se traduce que este experimento no tiene una muy buena repetibilidad, haciendo que este componente pueda ser descartado de antemano.

Figura 48. Curvas de calibración Champiñon.

96

 Papa: para la papa se utilizaron 30 g con un volumen de la muestra total de 40 ml.

Figura 49. Cantidad de papa utilizada en cada prueba.

Tabla 19. Pruebas con papa para un minuto de reacción.

Tiempo (min)

Concentración (Ppm)

0.2 1 2

1

Inicial Final Delta Inicial Final Delta Inicial Final Delta D.O

(%) 98 93.6 -4.4 98.3 93.7 -4.6 98 95.7 -2.3 98.9 96.4 -2.5 98.4 97.1 -1.3 98.6 95.9 -2.7 98.6 95.5 -3.1 97.9 95.8 -2.1 99.4 96.6 -2.8 Media 98.50 95.17 -3.33 98.20 95.53 -2.67 98.67 96.07 -2.60 Desviación 0.46 1.43 0.97 0.26 1.72 1.72 0.70 0.47 0.26

97

Figura 50. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con papa durante un minuto.

Tabla 20. Pruebas con papa para tres minutos de reacción.

Tiempo

Papa Tiempo de 1 minuto

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

98

Figura 51. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con papa durante tres minutos.

Tabla 21. Pruebas con papa para cinco minutos de reacción.

Tiempo

Papa Tiempo de 3 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

99

Figura 52. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con papa durante cinco minutos.

En la siguiente tabla se presenta un consolidado de la media y desviación estándar de la variación de oxígeno disuelto obtenida, con la papa para cada concentración de fenol en estas pruebas.

Tabla 22. Media desviación de los datos obtenidos en las pruebas con la papa.

Concentración estándar para cada uno de los tiempos posee un valor bajo, lo que se traduce que este experimento tiene una buena repetitividad, haciendo que sea un

Papa Tiempo de 5 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

100

candidato a seleccionar. Por otra parte, el valor de las medias para el tiempo de 5 minutos, están más distanciadas, es decir, se puede notar una mayor diferencia en la variación del oxígeno disuelto entre concentraciones.

Figura 53. Curvas de calibración para la papa.

 Manzana: Para la manzana se utilizaron 25 gramos con un volumen total de la muestra de 40 ml.

101

Tabla 23. Pruebas con manzana para un minuto de reacción.

Tiempo manzana durante un minuto.

0,3

Manzana Tiempo de 1 minuto

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

102

Tabla 24. Pruebas con papa para tres minutos de reacción.

Tiempo

Figura 55. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con manzana durante tres minutos.

-4,2

Manzana Tiempo de 3 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

103

Tabla 25. Pruebas con manzana para cinco minutos de reacción.

Tiempo

Figura 56. Variación de la cantidad de oxígeno disuelto después de la reacción con manzana durante cinco minutos.

-4,2

Manzana Tiempo de 5 minutos

0,2 ppm 1 ppm 2 ppm

104

Tabla 26. Media desviación de los datos obtenidos en las pruebas con manzana.

Concentración

0,2 1 2

Tiempo (min) Media Desv Media Desv Media Desv

Media desviaciones 1 -0,80 0,96 -0,87 0,29 -0,43 0,55 0,60 3 -7,63 0,76 -5,30 1,91 -4,47 1,72 1,46 5 -5,43 1,25 -4,00 1,23 -3,87 1,04 1,17

En la anterior tabla se puede observar que la media de las desviaciones estándar para cinco minutos posee un valor bajo, lo que se traduce que este experimento tiene una buena repetitividad. Por otra parte, el valor de las medias para el tiempo de tres minutos, están más distanciadas, es decir, se puede notar una mayor diferencia en la variación del oxígeno disuelto entre concentraciones a medida que aumenta el tiempo de reacción y al mismo tiempo posee un valor bajo en la media de las desviaciones, por lo que lo convierte en el candidato más opcionado para la siguiente etapa.

105

Figura 57. Curvas de calibración para la manzana.

106

8. DISEÑO MECATRÓNICO DEL SISTEMA DE MONITOREO PARA LA MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE FENOL.

En esta fase se describe el procedimiento desarrollado para el diseño del prototipo teniendo en cuentas las especificaciones generales del sistema.

8.1. Diseño asistido por computador del sistema para monitoreo de la concentración de fenol diluido en agua.

8.1.1. Diseño conceptual

En esta etapa del proyecto, se definen las especificaciones que el dispositivo debería tener para solucionar de manera adecuada el problema, estos requerimientos de diseño se definen buscando cumplir los objetivos propuestos, y se relacionan a continuación:

 Determinación de la concentración de fenol

 Monitoreo in situ de la concentración

 Visualización de la concentración de fenol en una interfaz gráfica

 Comunicación inalámbrica.

 Diseño portable.

8.1.1.1. Lluvia de ideas

107

A continuación se presenta la lluvia de ideas preliminar para dar solución al problema:

 Transductor ultrasónico  Alimentación monofásica

 Transductor piezoeléctrico  Xbee

108

8.1.1.2. Selección del sistema de medición

Estos criterios se establecen para determinar el método más selectivo y económico para su implementación en el sistema de medición.

 Sistema de medición:

Tabla 27. Selección sistema de medición.

Peso Sistema de medición Nariz electrónica Transductor Biosensor

30% Costo 3,5 4 3,5

40% Selectividad 4 3,8 4,5

30% Facilidad de construcción 3,5 3 4

Total 3,7 3,6 4,05

Se concluye de la tabla 14, que el sistema de medición adecuado debe ser el biosensor debido a su alta selectividad y a su facilidad de construcción con respecto a los demás.

109 8.1.1.3. Propuestas de diseño

A continuación se presentan las cuatro propuestas de diseño planteadas inicialmente.

En el primer diseño, se propone un sistema de tubería, con embudos (1 y 2) para el control del tiempo de la reacción, el sistema cuenta con dos sensores para la medición (3 y 4).

Figura 58. Boceto propuesta de diseño 1.

El diseño número dos, plantea un modelo con dos sensores (1 y 2) para la toma de datos antes y después de la reacción, el sistema está conformado por dos recipientes, uno grande con la mezcla (3) y uno más pequeño (4) con el reactivo,

110

el procedimiento es semi-asistido requiere de intervención directa por parte del usuario.

Figura 59. Boceto propuesta de diseño 2.

La propuesta de diseño número tres, está conformada por una caja (1) que contiene un recipiente (2) donde se genera la reacción, dentro de esta caja está dispuesto un mecanismo de subida y bajada (3) para el reactivo. El prototipo tiene como sistema de entrada una bomba (4) que alimenta la caja con la muestra.

1

2

3 4

111 Figura 60. Boceto propuesta de diseño 3.

La propuesta número cuatro consta de un sistema de tuberías (1) para el control y manejo de los tiempos de la reacción, de tal manera que cumpla con las condiciones adecuadas para la medición del sensor (2).

1

2 3

4

112 Figura 61. Boceto propuesta de diseño 4.

2

1

113 Tabla 28. Selección propuesta final de diseño.

Peso Diseño del sistema

Propuesta 1 Propuesta 2 Propuesta 3 Propuesta 4

40% Costo 4 3,2 3,2 4

30% Complejidad 4,2 4,4 3,5 4

30% Grado de automatización

3 3 4,4 4,4

Total 3,7 3,5 3,7 4,1

Se seleccionó la propuesta de diseño 4 principalmente por su bajo costo, esto se debe a que utiliza un solo sensor de oxígeno disuelto a comparación de las otras dos. Adicionalmente, posee un alto grado de automatización contribuyendo a darle una mejor solución al problema.

Como metodología de diseño mecatrónico se decidió implementar un QFD (Quality Function Deployment) que identifique los puntos relevantes a tener en cuenta en el proceso del desarrollo de dispositivo.

114

Figura 62. QFD (Quality Function Deployment)

Del diagrama QFD anterior, se puede concluir que los componentes de mayor relevancia son aquellos que permiten al sistema ser automático, es decir, el sensor y los actuadores. Además, el sistema de comunicación inalámbrica cumple un rol importante en uno de los requerimientos principales del prototipo, que es el monitoreo, porque entre sus funciones se encuentran la comunicación bilateral de datos y la interacción con la interfaz usuario-máquina controlada remotamente desde un PC.

115 8.1.2. Diseño mecánico

En esta sección del proyecto, se desarrolló el modelo CAD del sistema cumpliendo con los requerimientos necesarios planteados anteriormente.

Los criterios a evaluar están enfocados a una buena funcionalidad del prototipo a un bajo costo para su construcción.

 Estructura

Tabla 29. Selección Estructura.

Peso Estructura Tubería metálica Tubería PVC Manguera

30% Costo 3,8 4,2 4,5

40% Funcionalidad 4,6 4,5 4

30% Facilidad de construcción 3,8 4 3,8

Total 4,1 4,3 4,09

Se concluye de la tabla 25, que la estructura se debe realizar con tubería PVC debido a su bajo costo y su facilidad para la construcción del sistema.

 Cálculo presión hidrostática

Para garantizar la presión mínima de trabajo requerida para la operación de la electroválvula. Basado en la manera en que opera el sistema, se puede asumir un modelo estacionario, es decir, se hace necesario determinar la altura de la columna de fluido adecuada que genere dicho valor de presión.

116

Para el cálculo de la presión hidrostática se empleó la siguiente ecuación:

Ecuación 1. Cálculo de presión hidrostática.

𝑃 = ρ ∗ g ∗ h

Fuente: AMSCHOOL, Hidrostática.

Donde:

ρ: Densidad del fluido ( 𝑘𝑔/𝑚3).

g: Gravedad (𝑚/𝑠2)

h: Altura (𝑚).

𝑃:Presión (𝑃𝑎).

Despejando h y reemplazando con los siguientes valores:

ρ: 1000 ( 𝑘𝑔/𝑚3).

g: 9.8 (𝑚/𝑠2)

𝑃: 4500 (𝑃𝑎). (tomado de datasheet)

117 Se obtiene:

h: 0.45 (𝑚).

Para evitar operar por debajo de la presión mínima de trabajo, se aplicó un factor de seguridad del 20% al valor calculado anteriormente.

h: 0.55 (𝑚).

8.1.2.1. Modelo CAD

Este modelo está conformado por dos estructuras generales, el sistema hidráulico y la carcasa, el primero, es un diseño de tuberías en pvc, de media y una pulgada, posee dos válvulas para el control de la muestra durante el proceso de medición, y una bomba para el ingreso de esta en el sistema, el segundo es donde se ubicara el sistema hidráulico y la circuitería necesaria para su correcto funcionamiento.

118

 Sistema hidráulico

Figura 63. Modelo CAD del sistema hidráulico.

119

8.2. Simulación del sistema para la determinación de la concentración de fenol

8.2.1. Simulación de flujo del sistema

Se realizó un estudio de flujo en SolidWorks, para observar el comportamiento y la distribución del agua durante el proceso de llenado del sistema.

Debido a que por especificaciones de la bomba, el caudal de entrada al sistema es de 18 ml/s y el volumen total del sistema hidráulico es de 400 ml, el tiempo de llenado se calcula como se ve a continuación:

Ecuación 2. Cálculo de tiempo de llenado.

Ecuación 2. Cálculo de tiempo de llenado.

In document SISTEMA DE MONITOREO EN TIEMPO REAL PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE FENOL DILUIDO EN AGUA DESTILADA GILMAR HERNANDO TUTA NAVAJAS (página 72-0)