III. DISSENY de L’ESTUD
2. ESTUDIS in vitro
3.3. Model experimental
1er Dia: CAPPING: l’animal es va anestesiar amb una mescla de ketamina (35 mg/kg) i
xilacina (5 mg/kg) via im. Addicionalment se li va administrar 0,3 ml de meloxicam via sc. Amb la cara externa de les orelles i la calota cranial rasurades i desinfectades, se’l va sotmetre a una petita intervenció quirúrgica per a permetre la seva subjecció en l’aparell d’estereotàxia. Es va realitzar una incisió sobre l’eix longitudinal del crani a l’alçada de l’encreuament de les sutures sagital i coronal, es va separar el periosti i es van fer quatre
2on Dia: PREPARACIÓ del INÒCUL i INOCULACIÓ INTRACISTERNAL:
A partir d’una alíquota congelada es va fer una sembra en placa que va créixer durant tota la nit. D’aquest cultiu s’agafaren unes quantes colònies amb una nansa estèril i es van
resuspendre en un parell de tubs de vidre amb 10 ml de Brain Heart Infusion. Els tubs es
van incubar en una estufa a 37ºC durant 3-4 h. Passat aquest temps, s’ompliren dos tubs de vidre amb SF i cultiu bacterià a meitats iguals i es centrifugaren a 3000 g durant 10’. Es va descartar el sobrenadant i al precipitat es va afegir SF fins obtenir una DO de 0,5 McF (≈108 ufc/ml). Es van fer dilucions fins a una concentració bacteriana final de ≈ 106 ufc/ml, a partir de la qual es va realitzar un recompte com a control de l’inòcul amb dilucions seriades (1:10) i sembra de les dilucions: -3 (103 ufc/ml), -4 (102 ufc/ml), i -5 (101 ufc/ml) en plaques de TSA-5% SB que es van incubar 24 h fins la seva lectura.
Els animals es van anestesiar amb idèntica pauta que el primer dia. El conill es va col·locar en l’aparell d’estereotàxia. Es va desinfectar la zona del coll, es va palpar manualment la zona d’interès i es va introduir una agulla de punció lumbar de 25G en la
cisterna magna. Es va extreure un volum de 250 μl de LCR (mostra PRE: per a comprovar
l’esterilitat del LCR) i es va inocular el mateix volum de la solució bacteriana amb ≈106 ufc/ml.
El temps necessari per a obtenir uns recomptes bacterians inicials adequats per als posteriors estudis d’eficàcia (≈ 104-105 ufc/ml) va variar en funció de la soca estudiada. Per a la soca HUB 2349 va ser suficient un temps de 18-20 h postinoculació. No va ser el cas de la soca ATCC 51916 en la què va ser necessari esperar unes 40 h.
Tal i com s’il·lustra, es van inserir quatre cargols que fixaren una peça metàl·lica que, finalment, es va recobrir amb un “casc” de ciment acrílic.
Imatges per a representar la col·locació del conill en l’aparell d’estereotàxia i la punció intracisternal per inoculació i extracció de mostres de LCR.
3er Dia: Els conills es van anestesiar amb uretà al 20% (1,75 g/kg) via sc. Al cap d’una
hora, moment en què l’anestèsia va ser efectiva, es col·locà un catèter iv. pediàtric (22G) en la vena marginal de l’orella com a via d’administració antibiòtica/SF i per si s’hagués
A partir d’aquí els experiments es van dividir en tres línies de treball:
a) Estudi del comportament de les soques d’estudi en absència de tractament
Es va extreure una mostra de 0,1 ml de sang de l’artèria de l’orella per a determinar bacterièmia secundària.
Es va extreure una mostra de 0,2 ml de LCR corresponent a l’hora 0. Immediatament, es va administrar 1 ml de SF via iv. per a igualar les condicions d’administració que tindrien els animals destinats a la resta d’experiments.
Es van realitzar extraccions seriades de 0,2 ml de LCR a les hores: 2, 6, 24 i 26. A l’hora 24 es va determinar la mortalitat.
b)Estudis de farmacocinètica antibiòtica
Els experiments de farmacocinètica es van practicar en conills inoculats amb la soca S.
pneumoniae HUB 2349. No es van repetir amb l’altra soca perquè en tractar-se del mateix microorganisme les diferències esperades respecte a la penetració antibiòtica serien mínimes i en cap cas quedaria justificada la utilització de més animals.
Les dosis seleccionades van atendre a un únic criteri: l’obtenció d’uns nivells d’antibiòtic en LCR similars als que s’observen en humans.
Es va extreure una mostra de LCR (hora 0) i immediatament es va administrar 1 ml d’un dels antimicrobians via iv. Els punts horaris d’extracció de sang (0,5 ml/punt) i LCR (0,1 ml/punt) es detallen a continuació:
Extraccions de sang (h) Extraccions de LCR (h)
Ceftriaxona 100 mg/kg 0’5, 1, 2, 3, 5, 8 i 24 1, 2, 3, 5, 8 i 24
Fosfomicina 300 mg/kg 0’5, 1, 2, 3, 5, 8 i 24 1, 2, 3, 5, 8 i 24
Rifampicina 15 mg/kg 0’5, 1, 2, 3, 5, 8 i 24 1, 2, 3, 5, 8 i 24
Teicoplanina 15 mg/kg 1, 2, 5, 8, 10, 12 i 24 1, 2, 5, 8, 10, 12 i 24
Vancomicina 15 mg/kg 0’5, 1, 2, 4, 6, 12 i 24 1, 2, 4, 6 i 12
c) Estudis d’eficàcia antibiòtica
Es va extreure una mostra de 0,2 ml de LCR a l’hora 0. Es va administrar l’antibiòtic sol o combinat via iv.
Es van realitzar extraccions seriades de 0,2 ml de LCR a les hores: 2, 6, 24 i 26. A l’hora 24, es va determinar la mortalitat.
Les pautes antibiòtiques estudiades van ser:
ceftriaxona 100 mg/kg/d fosfomicina 300 mg/kg/6h teicoplanina 15 mg/kg/d vancomicina 15 mg/kg/12 h ceftriaxona + vancomicina fosfomicina + ceftriaxona fosfomicina + vancomicina fosfomicina + teicoplanina amoxicil·lina 300 mg/kg/6h rifampicina 15 mg/kg/d ceftriaxona + rifampicina vancomicina + rifampicina
Definicions:
Efecte Bactericida: quan es va aconseguir una reducció de ≥ 3 log ufc/ml respecte el recompte d’hora 0.
Efecte Bacteriostàtic: quan la reducció va ser de ± 1 log ufc/ml respecte l’hora 0.
Fracàs terapèutic: quan es va donar un increment d’almenys 1 log ufc/ml en la concentració bacteriana en un punt horari respecte l’anterior.
Recreixement bacterià: quan l’augment va ser de < 1 log ufc/ml vers l’hora anterior. Desenvolupament de resistència antibiòtica: quan l’increment en la concentració bacteriana va ser degut a un canvi en la CMI comprovat amb la tècnica de l’E-test
4art Dia: al final de cada experiment els animals que sobrevisqueren van ser sacrificats
amb una sobredosi de tiopental sòdic (1-2 ml) via iv.
En els estudis de comportament i eficàcia es va extreure el cervell per a determinar la en ambdues soques