El objetivo de este trabajo fue ensayar una terapia prenatal para el tratamiento del MMC humano, por lo que elegimos y destacamos las ventajas que presenta el modelo de MMC en rata inducido por AR. Este modelo consigue reproducir el defecto desde su inicio, por lo que en nuestros resultados se observaron los efectos del daño químico y mecánico. Además, este modelo teratogénico, se considera óptimo para la experimentación, ya que las ratas se reproducen con mucha facilidad y el tiempo de gestación es muy corto con lo que se pueden repetir los experimentos obteniendo resultados a corto plazo.
A pesar de todo ello, hemos tenido en cuenta que el pequeño tamaño y la rápida gestación de la rata son también una limitación para el estudio (Watanabe, Jo et al.
2010), ya que, aunque hacen más fácil la observación de los resultados y el calendario de los experimentos, algunas conclusiones no se pueden extrapolar a los humanos pues el tiempo de exposición al ambiente intrauterino desde que se produce el daño hasta que se repara, es muy corto (Fichter, Dornseifer et al. 2008). Este inconveniente puede que dificulte la capacidad terapéutica del tratamiento pues el tiempo de actuación de la terapia celular también es reducido (Kajiwara, Tanemoto et al. 2017) y son necesarios modelos complementarios como el de oveja, que en cuanto a su tamaño y tiempo de gestación se parece más al humano. Este modelo ovino serviría desde el punto de vista teórico, por tanto, para el análisis de los efectos de la terapia a largo plazo.
Sin embargo, el modelo quirúrgico ovino presenta una limitación temporal, puesto que el daño es generado de manera tardía comparado con la lesión humana, (Heffez, Aryanpur et al. 1993), (Hirose, Meuli-Simmen et al. 2003), (von Koch, Compagnone et al. 2005). En el modelo de rata, al contrario, el daño es generado temprano en la gestación, se induce un defecto primario durante la formación del tubo neural desde el momento de la neurulación en adelante, lo que consideremos como el valor añadido más importante de este modelo.
143 En cuanto al daño generado crónicamente en los fetos por la administración del AR a sus madres, el presente trabajo optimiza las dosis de teratógeno suministrando 100mg/kg (solución 12mg/ml) frente al usado por Díez-Pardo & co (Diez-Pardo, Marino et al. 1995), de 125mg/kg, 40mg/ml. De esta forma, se obtiene un mayor porcentaje de fetos con MMC (más de 50%, frente al 36 % del estudio del año 95), y también menor porcentaje de abortos por reabsorción del feto.
Cierto es que en otros estudios los porcentajes de MMC inducidos han sido mayores, incluso por encima de un 80% con dosis de 60mg/kg en estudios de Danzer (Danzer, Schwarz et al. 2005). Recientemente científicos colaboradores de este trabajo con el que opto al grado de Doctora, han publicado un artículo en el que se alcanza un porcentaje del 71% de fetos con MMC empleando la misma dosis de 100mg/kg de RA (Oria, Figueira et al. 2018).
Los primeros trabajos que explican el procedimiento teratogénico de administración de altas concentraciones de vitamina A en ratas gestantes para inducción de malformaciones mesodérmicas, datan de los años 60-70 (Morriss 1972) (Marin-Padilla 1966). Desde entonces numerosos autores han empleado la vitamina A también en hamsters y ratones (Wiley 1983, Tibbles and Wiley 1988), aunque el día de administración y la dosis también eran distintos. En los estudios de Tibbles y Wiley, la administración de una dosis de más de 90mg/kg se evaluó como letal en un 100% de los casos, aunque se trataba de ratones y hamsters, y los momentos de administración eran por ello distintos.
El defecto neural que se genera con la administración del AR en día 10 de gestación da lugar a una malformación que tiene unas similitudes morfológicas y clínicas sorprendentemente parecidas al MMC humano (Danzer, Schwarz et al. 2005, Danzer, Kiddoo et al. 2007, Danzer, Radu et al. 2008). Se ha descrito que la cola enrollada y la cola curvada son manifestaciones de espina bífida severa (Stiefel, Shibata et al. 2003).
144 En nuestros experimentos sólo 14 de 245 fetos (un 5,7%) presentaron la cola curvada, que se aproxima mucho al resultado obtenido por Danzer para una dosis de 60mg/kg de teratógeno (8,1%) (Danzer, Schwarz et al. 2005). Además, hay que tener en cuenta que en nuestro trabajo se observaron otras afecciones de la cola como la ausencia de ella (23,67%) o la “cola tipo botón” (20%), por lo que se podría concluir que casi la mitad de los fetos (49,79%) presentaban alguna afección de la cola.
Otro dato que hace pensar que la dosis de teratógeno utilizada en este trabajo es demasiado alta, se obtiene al comparar los pesos de los fetos. En los estudios de Danzer, en el que se administraban 60mg/Kg de AR, el peso medio en los fetos con MMC fue de 4,6g, mientras que en nuestro trabajo obtuvimos un peso medio de 3,48g.
En el caso de los fetos con RA administrado, pero sin MMC, el peso es casi el mismo:
4,6g en nuestro trabajo, frente a 4,9g en el referido (Danzer, Schwarz et al. 2005).
1.1. Descripción histológica del modelo
La histología de la malformación que se genera con el modelo teratogénico es muy similar a la del modelo humano y al de oveja (Stiefel, Copp et al. 2007, Al-Shanafey, Fontecha et al. 2013). En nuestro modelo no se han observado diferencias significativas entre animales enfermos y controles, a nivel torácico, todo lo contrario que lo observado a nivel lumbar. El daño en la médula a nivel lumbar aumenta progresivamente según avanza la gestación, observándose que a partir del día 19 existe el mismo grado de lesión que a término de la gestación. Además, en el presente trabajo, no hemos sido capaces de distinguir diferencias en el daño de la médula el día 15, aunque otros autores, describen diferencias desde el día 15´5. Sin embargo, este último estudio se realizó en ratones, siendo esta la causa de esa diferencia puesto que el desarrollo enratones está ya más avanzado en día 15,5 de lo que se observa en la rata y por tanto es lógico que estas diferencias se hayan observado muy temprano en la gestación
145 (Stiefel, Copp et al. 2007). En los experimentos de este trabajo, sólo hemos apreciado diferencias a partir del día 17 de gestación. Danzer describe que la médula a día 14 tampoco presenta cambios en la citoarquitectura ni cambios degenerativos o traumáticos, pero sí a partir del día 16. Danzer describe que la médula a partir de día 16 tiene abrasiones, -de medias a moderadas-, y pérdida de los elementos neurales localizados dorsalmente, lo cual se agrava según avanza la gestación (Danzer, Zhang et al. 2011).
El defecto medular se genera a nivel lumbar donde se ha observado un daño progresivo según avanza la gestación. A pesar de no observar diferencias el día 15 de gestación, a partir del día 17 la descripción del daño reproduce el MMC humano y coincide también con la descripción del MMC por AR que realizan otros autores (Danzer, Schwarz et al. 2005) (Dionigi, Ahmed et al. 2015) (Diez-Pardo, Marino et al. 1995) (Li, Gao et al. 2012).
En embriones humanos abortados, se ha observado que la histología de la médula a nivel de la displasia permanece relativamente normal hasta el día 55 de gestación (Osaka, Tanimura et al. 1978) (Lendon 1968). En otros estudios postmortem, se ha observado necrosis en la columna en las astas laterales y dorsales, al nivel de la placoda, sin embargo, hay una histología normal en las astas anteriores (Emery and Lendon 1973).
1.2. Las malformaciones esqueléticas
Nuestros resultados corroboran lo observado en estudios previos sobre la capacidad de reproducir las malformaciones esqueléticas en modelos de ratas gestantes tras la administración del AR. Las alteraciones esqueléticas observadas se localizaron en la región lumbar inferior y en las extremidades, presentando los arcos
146 vertebrales abiertos y disminución del número de vértebras, al igual que en los ejemplares estudiados por otros autores (Danzer, Schwarz et al. 2005).